阴道微生物芯片技术在阴道分泌物念珠菌检测中的应用

陈雷鸣，陈艺升，李 翠

（复旦大学附属妇产科医院检验科，上海 200011）

阴道炎是临床常见妇科炎症，主要分为细菌性阴道炎、真菌（念珠菌）性阴道炎和滴虫（阴道毛滴虫）性阴道炎。有研究结果表明，由念珠菌感染引起的念珠菌性阴道炎占女性阴道炎的20%～45%[1-2]。有75%的成年女性一生中至少会经历1次真菌性阴道炎，其中有40%～50%还会再次感染，约有5%会因复发而发展为顽固性真菌感染[3]。因此，及时、准确的诊断对有效治疗念珠菌性阴道炎具有重要意义。

念珠菌性阴道炎的诊断以临床症状和体征为基础，并经阴道分泌物病原学检查确诊。目前，临床主要通过阴道分泌物显微镜镜检和真菌（念珠菌）显色培养2种方法常规检查念珠菌。显微镜镜检法成本低、操作简单，但易受检验者经验和涂片制作质量的影响，且敏感性较低，容易因假阴性而漏诊。真菌培养法敏感性和特异性较高，可对念珠菌进行定性及定量检测，但成本高、操作复杂、培养时间长，常需要5 d才能出具完整报告。为了满足实际需求，临床亟待快速、简便、准确性高的检测方法用于念珠菌性阴道炎的诊断。阴道微生物芯片检测技术以核酸杂交原理为基础，可捕获念珠菌属独特的基因序列，具有敏感性高、特异性好、操作简便等优点。本研究拟比较阴道分泌物涂片镜检、念珠菌显色培养和阴道微生物芯片检测3种方法诊断念珠菌感染的效能，以探索快速、简便、准确性高的检测方法，为提高念珠菌性阴道炎的实验室检测水平提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2017年12月—2018年7月于复旦大学附属妇产科医院门诊就诊的疑似阴道炎患者233例，采用无菌拭子采集患者阴道分泌物，采集后立即送检。

1.2 仪器与试剂

自配10% KOH溶液，酵母菌显色培养基购自梅里埃（上海）生物制品有限公司，阴道微生物检测试剂盒（BD Affirm VP Ⅲ）及微探针自动处理仪购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 常规镜检法 阴道分泌物用生理盐水涂片，显微镜下进行常规镜检，滴加1滴10%KOH溶液混合后镜检，以提高阳性率，发现卵圆形真菌孢子、芽生孢子及假菌丝，判读为阳性；无孢子或假菌丝，则判读为阴性[4-5]。

1.3.2 真菌显色培养法 将阴道分泌物接种于酵母菌显色培养基上，35℃培养24～48 h，根据培养基上有无真菌生长判定结果[5]。

1.3.3 阴道微生物芯片法 按照BD Affirm VPⅢ检测试剂盒使用说明书进行操作和结果判读。将裂解液加入采样管，80℃加热裂解样本10 min，加入缓冲液混合震荡，将过滤后的液体加入试剂板盒，再加入显色液，插入试剂板，放入微探针自动处理仪运行程序，程序结束后根据阴阳性对照判读结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料采用x2检验和Kappa一致性检验。Kappa值≥0.75，说明一致性较好；Kappa值＜0.40，说明一致性不理想；Kappa值为0.40～0.74，说明一致性在可接受范围内。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积评价3种方法诊断念珠菌感染的效能。

2 结果

2.1 3种方法检测结果比较

以显色培养结果为标准，对镜检法和阴道微生物芯片法的检测结果进行比较，Kappa值分别为0.415和0.821，阴道微生物芯片法与显色培养法具有较高的一致性；与显色培养法比较，镜检法阳性率较低（P＜0.001）。见表1。

表1 3种方法检测结果比较 例

2.2 ROC曲线分析

镜检法、阴道微生物芯片法诊断念珠菌感染的ROC曲线下面积分别为0.73、0.92，阴道微生物芯片法临床应用价值更高。见图1。

图1 阴道微生物芯片法和镜检法诊断念珠菌感染的ROC曲线

3 讨论

由真菌引起的阴道炎被称为念珠菌性阴道炎或真菌性阴道炎，是阴道感染的第二大病因[6]。及时、准确的实验室诊断对临床及时进行抗真菌治疗有重要意义。

显微镜镜检是常规检测念珠菌最直观的方法，10 min即可出具报告，操作简单、成本低。近年来，随着抗真菌药物的过度使用，耐药菌株不断增多，镜下观察孢子结构常不典型，鉴别诊断比较困难，易造成漏检，对检验人员的经验要求较高。而热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等不生长菌丝的念珠菌，镜检漏检率更高[7]，大大延误了临床诊断与治疗。真菌显色培养法是检测念珠菌的金标准，可以进行菌种鉴定和体外药物敏感性试验，并可指导临床用药，避免耐药菌株的出现，尤其针对顽固性、复发性念珠菌感染更为有效，但检测时间较长，一般需要4～5 d才能出具完整报告，不利于疾病的早期诊断和治疗。而且，真菌显色培养法检验操作流程较繁琐，成本较镜检法高，且需要检验人员具有相应的微生物检验专业技能。

阴道微生物芯片技术是以核酸杂交原理为基础，采用与念珠菌独特的基因序列互补的2个不同的捕获探针和显色探针，通过显色反应判读结果，成本较镜检法和培养法高，但1 h即可出具报告，操作简便、敏感性高、特异性好，且对检验人员专业要求不高，可操作性强。

本研究结果显示，镜检法假阴性率为53.9%，敏感性为46.1%，与显色培养法结果的符合率为68.9%；阴道微生态芯片法检测念珠菌的假阴性率为16.4%，敏感性和特异性分别为83.6%和100.0%，与显色培养法结果的符合率为90.7%，结果一致性较高。CARTWRIGHT等[7]报道阴道微生物检测试剂盒检出念珠菌属的敏感性、特异性和准确性分别可达到82.3%、98.4%和95.2%，与本研究结果基本一致。ROC曲线分析结果显示，阴道微生物芯片法诊断念珠菌感染的曲线下面积为0.92，具有较高的诊断价值，而镜检法诊断念珠菌感染的曲线下面积仅为0.73。

念珠菌为条件致病菌，一般情况下无临床症状不需要治疗，但其繁殖到一定数量时，可引发真菌性阴道炎。无症状患者阴道分泌物念珠菌浓度＜1×103CFU/mL，有症状患者浓度≥1×104CFU/mL[8]，但念珠菌培养均为阳性。阴道微生物芯片检测试剂盒对于念珠菌的分析灵敏度在每次检测的对数期内为1×104CFU/mL[9]，因此阴道微生物芯片检测技术可以避免因培养阳性而造成的念珠菌性阴道炎临床诊断的假阳性结果。本研究中显色培养阳性而阴道微生物芯片法结果为阴性的21例样本，即是上述原因造成。

镜检法虽然操作简单、方便快捷，但是由于阴道分泌物样本中各种细胞易造成干扰，且受检验人员专业素质、环境等因素影响较大，易造成漏检和误检，比较适合大规模筛查。真菌培养法阳性率和准确度高，但其缺点是操作繁琐、耗时长。阴道微生物芯片技术通过检测特异性基因序列，检测时长仅为1 h，极大地提高了检测效率，突破了传统检测方法的局限性。同时，阴道微生物芯片法还可以同时检测阴道毛滴虫和阴道加德纳菌，有助于3种常见真菌性阴道炎的临床诊断。

目前，传统检测技术已经无法满足临床需要，阴道微生物芯片技术有助于念珠菌性阴道炎的早期诊断，具有较高的实用价值。