肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-catenin信号通路对6-HODA致帕金森病大鼠的神经保护作用

帕金森症(Parkinson′s disease，PD)是世界范围内发病率仅次于阿尔茨海默病的第二大神经系统退行性疾病，临床表现为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓等，病理特征为脑黑质致密部多巴胺神经元损伤，纹状体多巴胺水平下降[1-2]。Wnt/β-catenin信号通路在中枢神经发育过程中发挥重要作用，该信号通路在PD发病过程中的作用受到越来越多关注[3]。肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶肉质茎，具有神经保护、提高免疫力、抗衰老等多种功能[4]。有研究证实，肉苁

蓉的有效成分肉苁蓉多糖(cistanche deserticola polysaccharides，CDPS)通过多种细胞因子调节PD动物模型的临床症状[5]，但CDPS对Wnt/β-catenin信号通路是否具有调节作用报道较少。本研究旨在探讨CDPS能否通过激活Wnt/β-catenin信号通路对6-羟多巴胺(6-HODA)所致PD大鼠的受损神经起到保护作用，为PD提供新的治疗思路和研究靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性成年SD大鼠45只，周龄6～7周，体重200 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。造模前实验动物饲养于SPF级环境1周。

1.2 实验试剂 肉苁蓉生药由我院中药房提供，提取CDPS；6-HODA、抗坏血酸购自美国Sigma公司；兔抗Wnt、β-catenin单抗购自美国Cayman公司；糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-actin引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 PD大鼠动物模型建立 随机选取SD大鼠30只，以戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，将实验动物固定于脑立体定位仪上，沿颅顶正中线切开皮肤，钝性分离头骨外膜，参考大鼠脑定位立体图谱，确定右侧纹状体坐标(前囟前1.0 mm，中线右3.0 mm，硬膜下4.5～5.0 mm)，将8 μg的6-HODA溶于含0.2%坏血酸的生理盐水中，使用微量注射器抽取后，以1 μL/min速度注射于上述两个靶点，注射后停针10 min，之后缓慢退针(2～3 min)。建模成功标准：建模1周后，腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)，诱发大鼠旋转，大鼠恒定向左旋转，且30min内旋转圈数>210圈视为造模成功。

1.4 实验动物分组及干预方法 将45只大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(PD组)和肉苁蓉多糖治疗组(CDPS+PD组)，各15只，每组进行不同干预。

1.4.1 CDPS+PD组 造模3周后，每日给予造模成功的SD大鼠CDPS灌胃治疗，剂量为1.08 g/(kg·d)，连续治疗10 d。

1.4.2 PD组 造模3周后，每日给予造模成功的SD大鼠与CDPS+PD组相同体积的生理盐水灌胃处理，连续治疗10 d。

1.4.3 Sham组 手术过程同PD组，只是注射等体积生理盐水，3周后每日给予SD大鼠与CDPS+PD组相同体积的生理盐水灌胃处理，连续治疗10 d。

1.5 实验动物行为学观察

1.5.1 游泳实验 第32天，将SD大鼠置于一个20cm×20cm×25cm体积水缸内，水深10cm，水温20～22℃，安静环境下，记录SD大鼠5min内静止时间。

1.5.2 自主活动实验 第32天，制作一个30 cm×30 cm×15 cm的有机玻璃盒，底部标注6 cm×6 cm方格，置于安静、昏暗环境中，统计SD大鼠5 min内站立次数，连续观察5次，取平均值。

1.6 组织标本提取 第32天，将SD大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，仰位固定于工作台上，沿腹中线剪开皮肤，暴露腹腔，预冷生理盐水灌注心脏，取脑组织，于-80 ℃条件下保存。

1.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测SD大鼠脑黑质内Wnt1、β-catenin蛋白表达 将冻存的脑组织剪成碎块，加入蛋白裂解液，离心后取上清液，电泳分离蛋白，将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，使用含5%脱脂乳粉的TBST封闭，按顺序添加一抗、二抗，洗涤NC膜，增强化学发光法(ECL)显色，胶片扫描后使用Bandscan5.0软件分析蛋白条带灰度。

1.8 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GSK-3β mRNA表达 将冻存脑组织加液氮研磨，使用Trizol提取总RNA，行逆转录反应。取2 μL RNA进行PCR扩增：内参为β-actin，内参引物序列，正向引物：TCGGCTATTCGGCTAGCTAGC；反向引物：TCGGTCGATTAGCTAGCCGCA；GSK-3β mRNA引物序列，正向引物：TCGATTCGATCGGGCTAGCTA；反向引物：TACGGTAGCGGCTAGCTAGG。扩增条件：95 ℃预变性2 min，1个循环；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃总延伸6 min。取5 μL PCR扩增产物进行电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，分析目的基因和参比基因的条带灰度。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学观察结果比较 与Sham组比较，PD组游泳静止时间增加(P<0.05)，CDPS+PD组游泳静止时间较PD组缩短(P<0.05)；PD组自主活动站立次数较Sham组下降(P<0.05)，CDPS+PD组站立次数明显恢复(P<0.05)。详见表1。

组别只数游泳静止时间(s)自主活动站立次数(次)Sham组1595.93±7.31①21.18±4.22①PD组 15172.19±19.02 10.24±2.35 CDPS+PD组15128.03±10.33①17.74±4.20①

与PD组比较，①P<0.05。

2.2 各组大鼠脑黑质内Wnt1蛋白表达 PD组大鼠脑黑质内Wnt1蛋白表达少于Sham组(P<0.05)，且CDPS+PD组Wnt1蛋白水平较PD组提升(P<0.05)。详见图1。

与PD组比较，＊P<0.05。

2.3 各组大鼠脑黑质内β-catenin蛋白表达 PD组大鼠脑黑质内β-catenin蛋白水平低于Sham组(P<0.05)，CDPS+PD组大鼠脑黑质内β-catenin蛋白水平高于PD组(P<0.05)。详见图2。

与PD组比较，＊P<0.05。

2.4 各组大鼠脑黑质内GSK-3β mRNA表达 PD组大鼠脑黑质内GSK-3β mRNA高于Sham组(P<0.05)，CDPS+PD组脑黑质内GSK-3β mRNA较PD组下降(P<0.05)。详见图3。

与PD组比较，＊P<0.05。

3 讨 论

PD是由中脑黑质多巴胺神经元选择性退行性病变引起的[2]。近年来，Wnt信号通路在PD中的作用日益重视。Wnt根据细胞内信号通路不同分为两类，在Wnt/β-catenin通路中发挥作用的是Wnt1，该通路是所有Wnt通路中重要的一条[6]。该通路在PD小鼠模型中脑黑质多巴胺神经元病理生理过程中发挥重要作用[3]。动物实验证实，干扰小鼠中脑β-catenin严重减弱多巴胺神经元再生能力及多巴胺神经元完整性[7]；体外研究证实，Wnt1在中脑前体细胞中促进其分化为多巴胺神经[8]，同时Wnt1缺失导致多巴胺神经元增殖能力下降[9]。本研究结果可见，6-HODA所致PD大鼠脑黑质组织Wnt1和β-catenin表达较Sham组大鼠均较低，说明PD大鼠脑组织内Wnt1和β-catenin作用被阻断，该结果与相关研究[8-9]报道一致。

GSK-3β是Wnt/β-catenin通路重要组成分子，该通路激活后，GSK-3β活性被抑制，从而增加β-catenin稳定性[10]。Gong等[11]研究发现，6-HODA能激活GSK-3β，进而导致中枢神经细胞凋亡，同时GSK-3β阻断剂可抑制PD大鼠神经元凋亡；另有研究报道，中脑多巴胺前体细胞抑制GSK-3β活性可增加β-catenin水平，同时促进多巴胺神经元增殖和分化[12]。本研究结果显示，给予SD大鼠颅内注射6-HODA后，GSK-3β mRNA表达高于Sham组，说明6-HODA能激活GSK-3β使其表达上调，同时抑制Wnt/β-catenin通路活性。

肉苁蓉具有免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用[4]。有研究证实，肉苁蓉的有效成分在中枢神经保护方面发挥重要作用，对脑卒中、PD、阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病具有良好的防治作用[5]。有研究证实，肉苁蓉中苯乙醇总苷能改善PD小鼠临床症状，提高纹状体内多巴胺水平[13]；另有研究发现，松果菊苷(ECH)通过抗氧化作用而减少氧化应激反应，保护多巴胺神经元免受氧化应激损伤[14]。CDPS是肉苁蓉的一种主要化学成分，其对PD的防治研究目前报道较少。本研究采用CDPS干预6-HODA所致的帕金森SD大鼠，治疗后SD大鼠自主活动能力提高，脑黑质内Wnt1和β-catenin蛋白表达较PD组提高，GSK-3β基因表达受到抑制，说明CDPS能改善PD大鼠临床症状，这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路而产生的。

综上所述，CDPS可改善6-HODA所致PD大鼠临床症状，这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制GSK-3β活性而发挥多巴胺神经保护作用而实现的。今后将进一步从细胞分子水平探讨肉苁蓉对PD动物模型中枢神经细胞保护作用的具体机制。