响应面法优化紫叶李皮中总多酚的提取工艺及其抗炎活性

高剑，孙焕然，国洪宾，陈保华，周程艳

(河北大学 药学院，河北省药物质量分析控制重点实验室，河北 保定 071002)

炎症是机体抵抗有害刺激产生的防御性反应，在炎症过程中，一方面是以防御为主的天然的局部反应，对机体是有利的，而另一方面，炎症又是有潜在危害的，过度的炎症反应会对机体造成严重的炎性损伤，这种炎性损伤主要是由炎症部位大量的活性氧、O2-、·OH的产生引起的氧化损伤，主要表现为红、肿、热、痛及功能障碍.过度剧烈和不受控制的炎症可导致机体产生多种疾病，如肿瘤、高血压、糖尿病、老年性痴呆等，涵盖多个系统器官，严重危害人类的健康[1-3].二甲苯致小鼠耳肿胀及蛋清致大鼠足趾肿胀模型是常用的急性炎症模型，因此在本文研究中笔者采用了此二者模型.目前临床上使用的抗炎药物主要是非甾体抗炎药及糖皮质激素药物，长期服用会产生严重的副作用，对机体造成一定的损害.相比较而言，传统中药、天然产物药具有多靶点作用，药效良好，无成瘾性，不良反应少及资源丰富等优势，具有重要的开发利用价值.

植物总多酚是从植物中提取的一类含有多个活性酚羟基的生物活性物质，是天然抗氧化剂，能有效清除有害的活性氧和自由基，具有抗炎、抗氧化、延缓衰老等多种生物活性[4-5].目前，随着植物多酚的广泛应用，多酚类研究已经成为热点.紫叶李(PrunusCerasifera)为蔷薇科李属药食两用的植物，原产于中亚和中国新疆天山地区，在中国广泛种植，其皮中含有大量的多酚和黄酮类化合物，亦含有萜类、苷类以及维生素等多种成分，具有良好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等生物活性，有较大的开发价值[6-8].目前，根据最新文献表明，紫叶李(PrunusCerasifera)皮中总多酚(PTP)的提取工艺和抗炎作用的研究在国内外均不够深入.响应面分析法是利用相关的实验方法，对影响因素进行设计并通过实验得到一定的数据，将所得实验结果进行方差分析、回归分析，来寻求最优工艺参数，从而可实现设计实验、回归分析、预测优化的功能，其设计模型种类包括Central Composite、Box-Behnken、D-optimal、均匀设计等，而其中Box-Behnken设计应用更为广泛，便捷，更利于设计和优化提取工艺参数[9].因此，在本文中笔者选择了Box-Behnken设计进行相关响应面分析，优化PTP的提取工艺，提取制备了PTP，并对其体内抑制小鼠耳廓及大鼠足趾炎症进行了研究，为紫叶李的进一步开发研究提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性昆明种小鼠40只，体质量(20±2)g；SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，均购于北京维通利华生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0002.

1.2 材料与试剂

紫叶李于2018年8月在河北省保定市河北大学校园采摘，经河北大学周程艳副教授鉴定为蔷薇科李属植物紫叶李(Prunuscerasifera)的正品，并经晒干后备用.标本(A1201808001) 存放于河北大学药学院生药学与天然药物化学研究平台.没食子酸标准品(上海金穗生物科技有限公司)、福林酚试剂(山东西亚化学股份有限公司)、复方金银花颗粒由广西凌云县制药有限责任公司生产，无水碳酸钠、无水乙醇、二甲苯、浓硫酸均购于天津市北辰方正试剂厂.

1.3 主要仪器

Synergy HT酶标仪(Gene Company Limited),RE-5299 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、HH-2型数显恒温水浴锅(金坛市荣华仪器制造有限公司),SHD-Ⅲ型循环水真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司),LGJ-18冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司),H2518D型离心机(上海知信实验仪器技术有限公司).

1.4 方法

1.4.1 没食子酸标准曲线的绘制

制备100 μg/mL的没食子酸标准品溶液.准确量取没食子酸标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，分别加入福林酚试剂0.5 mL，振摇1 min，再分别加入质量分数20% 碳酸钠溶液2 mL，摇匀，加蒸馏水至刻度，室温下避光放置2 h，750 nm 波长处测定吸光度[10]，以没食子酸标准品溶液质量浓度(x)为横坐标，吸光度A750nm(y)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=111.81x+0.068 9，相关系数R2=0.999 0.表明在 0.001～0.01 mg/mL 内没食子酸质量浓度与吸光度A750 nm线性关系较好.

1.4.2 PTP的提取及其含量测定

准确称取2 g紫叶李皮，按照一定的料液比加入乙醇溶液，并在一定的温度和时间的条件下回流提取，提取液定容至100 mL.精密量取该溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用体积分数60%乙醇定容.准确吸取该溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，然后按照“1.4.1”方法测定750 nm波长处的吸光度.计算总多酚得率，总多酚提取得率按下式计算：

总多酚得率(mg/g)=ρ×K×V/m,

式中：ρ为供试品溶液中总多酚的质量浓度 (g/L)，V为提取液的体积 (mL)，K为稀释倍数，m为提取所用紫叶李的质量(g).

1.4.3 方法学考察

通过重复性实验、精密度实验和稳定性实验考察福林酚试剂法测定结果的准确性和重复性.重复性实验：精密量取6份标准品溶液1.0 mL，然后按照“1.4.1”方法操作，测定750 nm波长处的吸光度，结果证明RSD=1.97%(n=6).精密度实验：精密量取1份标准品溶液1.0 mL，然后按照“1.4.1”方法操作，重复测定6次750 nm波长处的吸光度，结果证明RSD=0.74%(n=6).稳定性实验：精密量取1份标准品溶液1.0 mL，然后按照“1.4.1”方法操作，测定750 nm波长处的吸光度，结果表明在90 min内溶液的稳定性良好，RSD=1.81%.

1.4.4 总多酚的纯化

准确移取一定量PTP粗提液，在pH 7.0条件下加入CaCl2，加入量为紫叶李皮质量的1.5倍，离心分离，即得多酚钙盐沉淀.向多酚钙盐沉淀物中以料酸比1∶1.5(mg∶mL)加入3 mol/L硫酸溶液，搅拌，放置，使之溶解.将转溶后得到的清液，用乙酸乙酯进行萃取，多酚酸溶液与乙酸乙酯萃取比为1∶2(体积比)，进一步纯化多酚[11].旋转蒸发浓缩，真空干燥即得PTP成品，备用.

1.4.5 单因素实验

单因素实验分别考察乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比对PTP得率的影响，每个实验重复3次.乙醇体积分数采用40%、50%、60%、70%、80%5个水平；提取时间采用0.5、1、1.5、2、2.5 h 5个水平，提取温度采用50、60、70、80、90 ℃ 5个水平；料液比(g∶mL)采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 5个水平.

1.4.6 响应面优化实验设计

根据Box-Behnken实验设计原理，在单因素实验的基础上，选取乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、料液比(D)4个因素为自变量，以总多酚得率为响应值，进行4因素3水平实验设计，实验因素及水平见表1，数据采用Design-Expert 8.0.6统计软件分析.

表1 响应面实验因素水平

1.4.7 总多酚提取物对蛋清致大鼠足肿胀的影响[12]

取健康SD大鼠40只，随机分成4组，每组10只，即模型组(MG，等量生理盐水)、复方金银花颗粒组(CHGG，10 g/kg)、总多酚高剂量组(THPG，5 g/kg)、总多酚低剂量组(TLPG，2.5 g/kg)，每日灌胃1次，连续5 d.末次给药1 h后，于各组大鼠左后足趾皮下注射体积分数10%新鲜蛋清0.1 mL，用游标卡尺分别测量致炎后大鼠0.5、1、2、4 h的左足趾厚度.计算肿胀度、肿胀抑制率[13].

足趾肿胀度(mm)=致炎后左足趾厚度-致炎前左足趾厚度，

足趾肿胀抑制率=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%.

1.4.8 总多酚提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响[14]

取健康昆明种小鼠40只，分组，给药方法同“1.4.7”，末次给药1 h后，于各组小鼠左耳廓均匀涂抹二甲苯0.05 mL致炎，右耳廓作对照.涂药1 h后脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下左、右耳，用直径为6 mm打孔器分别于同一部位打下2耳片，精密称重，计算肿胀度、肿胀抑制率.

耳肿胀度(mg)=左耳质量-右耳质量，

耳肿胀抑制率=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%.

1.4.9 统计学分析

根据 Design-Expert 8.0.6 软件设计出的PTP提取方案进行PTP相关提取工艺的确定，最后得出其最佳提取工艺.然后，进行相关的工艺验证实验，并与预测值相比较，此部分实验需要进行3次重复.

2 结果与分析

2.1 总多酚的含量测定结果

重复性实验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.97%，表明该方法重复性良好.精密度实验中吸光度的相对标准偏差RSD为0.74%，表明仪器精密度良好.稳定性实验中吸光度的相对标准偏差RSD为1.81%，表明总多酚溶液在90 min内稳定性良好，因此该方法可用于总多酚的含量测定.

2.2 响应面实验结果与分析

2.2.1 单因素实验结果

在提取温度50 ℃，提取时间1.5 h，料液比1∶30条件下，当乙醇体积分数为70%时，PTP得率达到最大值，之后随着乙醇体积分数的进一步增加得率降低.在乙醇体积分数60%，提取温度50 ℃，料液比1∶30条件下，提取时间为1.5 h，PTP得率达到最大值，之后随着提取时间的延长，PTP得率降低.在乙醇体积分数60%，提取时间1.5 h，料液比1∶30条件下，提取温度为50～80 ℃，PTP得率随着温度的升高而不断增加，提取温度80 ℃时，PTP得率最高.在乙醇体积分数60%，提取时间1.5 h，提取温度50 ℃条件下，料液比为1∶15～1∶30时，随着料液比值的增加，PTP得率不断增加，在1∶30时达到最大值，之后得率迅速下降.具体测定结果见表2.

2.2.2 响应面实验设计及结果

表2 不同因素对PTP得率的影响

表3 响应面实验设计及结果

表4 回归模型方差分析

P<0.05，差异显著；P<0.01，差异极显著.

2.2.3 响应面优化结果与分析

响应面图与等高线图可以直观地反映各因素间的交互作用对响应值的影响程度.响应面坡度陡、等高线密集成椭圆形表示两因素交互作用显著，反之则表示两因素交互作用不显著.上述提取PTP的响应面图和等高线图见图1A，图1B和图2,由图1A,图1B可知每个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，存在最高点，即图2等高线最小椭圆的中心点，说明响应值(PTP的得率)在4个因子设计的范围存在最大值.

图1A 提取时间和乙醇体积分数(a)、提取温度和乙醇体积分数(b)、料液比和乙醇体积分数(c)对PTP得率影响Fig.1A Response surface plots showing the effects of extraction time and volume fraction of ethanol(a)、extraction temperature and volume fraction of ethanol(b)、solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol(c)on extraction rate of PTP

图1B 提取温度和提取时间(d)、料液比和提取时间(e)、料液比和提取温度(f)对PTP得率影响的响应面Fig.1B Response surface plots showing the effects of extraction temperature and extraction time (d)、solid-liquid ratio and extraction time (e)、solid-liquid ratio and extraction temperature (f)on extraction rate of PTP

图2b、c等高线近圆形，说明乙醇体积分数和提取温度、乙醇体积分数和料液比交互作用均不显著.从图2a、d可以看出，等高线均呈椭圆形，初步表明乙醇体积分数和提取时间、提取时间和提取温度交互作用显著，与方差分析结果吻合.由图2e、f可知，等高线呈扁椭圆型趋势，说明料液比和提取时间、料液比和提取温度的交互作用极显著.轴向料液比相对于提取时间、提取温度等高线均密集，表明料液比对PTP得率的影响较大，与方差分析结果一致.

图2 提取时间和乙醇体积分数(a)、提取温度和乙醇体积分数(b)、料液比和乙醇体积分数(c)、提取温度和提取时间(d)、料液比和提取时间(e)、料液比和提取温度(f)对PTP得率影响的等高线Fig.2 Contour plots showing the effects of extraction time and volume fraction of ethanol (a)、extraction temperature and volume fraction of ethanol (b)、solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol (c)、extraction temperature and extraction time (d)、solid-liquid ratio and extraction time (e)、solid-liquid ratio and extraction temperature (f)on extraction rate of PTP

2.2.4 最佳提取工艺确定与验证结果

通过软件分析确定总多酚的最佳提取条件为：乙醇体积分数69.3%，提取时间1.515 h，提取温度80.9 ℃，料液比1∶30.55，PTP得率的理论值为55.7 mg/g.考虑到实际情况，修正为：乙醇体积分数69%，提取时间1.5 h，提取温度81 ℃，料液比1∶31.在此条件下进行3次平行验证实验，得到PTP得率平均为55.3 mg/g，实测值与理论值无显著影响(P<0.05)，此结果说明利用响应面法优化PTP得率的数值是真实可靠的.

2.3 PTP抗炎作用的结果与分析

a.空白组;b.模型组;c.复方金银花颗粒组；d.总多酚高剂量组；e.总多酚低剂量组.图3 大鼠足趾肿胀Fig.3 Swelling of rat toe

2.3.1 PTP对蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响

根据上述检测方法的结果显示：BG大鼠足趾无肿胀，趾间关节结构明显；MG大鼠足趾有严重的肿胀，足底厚度明显增大，趾间关节结构不明显；CHGG与THPG大鼠足趾肿胀程度明显减轻，TLPG大鼠足趾肿胀程度有轻微改善.在给药后0.5～2 h，THPG大鼠足趾肿胀程度与MG相比差异极显著(P<0.01)，TLPG与MG相比差异显著(P<0.05)，在4 h时THPG、TLPG与MG相比均无显著性差异.THPG、TLPG均在用药后2 h肿胀抑制率达最高，而后肿胀抑制率相对降低，THPG的抑制率明显高于TLPG.由此可见，PTP对蛋清所致大鼠足趾肿胀有明显的抑制作用.具体测定结果见图3和表5.

表5 总多酚对蛋清致大鼠足趾肿胀度的影响(±s,n=10)

*P<0.05,**P<0.01.

2.3.2 PTP对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

根据上述检测方法的结果显示，BG耳廓微红色，无肿胀现象，与之相比，MG耳廓有明显的红、肿现象，CHGG、THPG、TLPG耳廓肿胀程度较MG有明显的减轻，但差异并不显著.致炎后，炎症的症状如水肿、组织增生、血管扩张的发生会引起耳朵增重，检测耳朵的质量差，可作为评价抗炎药物药效的指标.THPG、TLPG的肿胀度与MG相比有极显著差异(P<0.01)，对小鼠耳肿胀的抑制率分别为21.68%、10.56%.结果表明，PTP对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用，且抑制作用与剂量成正相关.测定结果见图4和表6.

a.空白组;b.模型组;c.复方金银花颗粒组;d.总多酚高剂量组;e.总多酚低剂量组.图4 小鼠耳廓肿胀Fig.4 Swelling of ear laps in mice

表6 总多酚对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

*P<0.05,**P<0.01.

3 讨论

近年来，响应面分析法在优化黄酮、多糖、多酚等天然有效成分的提取工艺中得到了广泛应用，与传统的正交设计实验相比，响应面法对数据分析更为详细，不仅可以直观看出各因素对提取物得率影响的显著情况，还可以进一步分析两因素间存在的交互作用，借助软件可以三维模拟出更直观更精准的最佳工艺，预测值准确性较高[15].Song W等[6]测定紫叶李叶片中提取的PTP质量分数为(117.8±8.8)mg/g，枝条中提取的PTP质量分数为(100.04±1.9)mg/g；汪洪涛[16]等测得紫叶李果实中提取的PTP质量分数18.13 mg/g.但是未见PTP的提取和活性的研究，因此本实验通过响应面法优化PTP的提取工艺，并得出最优工艺为乙醇体积分数69%、提取时间1.5 h、提取温度81 ℃、料液比1∶31 ，该工艺下PTP的得率为55.3 mg/g.与Song W[6]和汪洪涛等[15]的实验研究相比，笔者发现紫叶李不同部位的PTP含量还是有一些差异的.同时紫叶李PTP的含量也会受成熟度、品种、环境条件、生长季节等的影响[17].

综上所述，本研究通过响应面法优化的PTP提取工艺设计合理，可在连续范围内进行分析，重现性好、提取得率较高,对其工业化生产有一定的指导意义.PTP具有良好的抗炎作用，其作用机制可能与有效清除有害的活性氧和自由基等有关.本实验结果将为今后进一步研究PTP抗炎活性的临床应用提供参考，为提高紫叶李树综合经济效益提供一定依据.