Cd胁迫对波斯菊种子萌发、幼苗耐性及富集的影响

刘翰升，赵春莉，刘 玥，国伟强，王 蕾

(吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118)

随着我国城市化进程的加深，城市土壤污染日益严重，土壤重金属含量超标是重要原因[1]，其中Cd是一种生物非必需的重金属元素，毒性较高，被认定是最重要的重金属污染物之一[2]。植物修复是以植物忍耐、分解或超量积累某种或某些化学元素的生理功能为基础，利用植物及其共存微生物体系来吸收、降解、挥发和富集环境中污染物的技术[3]，具有原位修复、经济效益高、修复高效、环境友好、不破坏土壤结构、无二次污染风险等特点[4-5]。采用植物修复技术治理重金属污染土壤成为当前环境治理研究的热点之一。

植物种子发芽生长是植物生命周期的起点和感知外界环境变化的最初阶段[6]，也是观察植物受重金属胁迫时抗性与耐性高低的重要时期，这时期内植物主要通过调节自身的生理生化反应来适应外部环境[7]，而且植物会通过进化演变出相关的忍受机制来缓解伤害[8]。重金属胁迫种子的发芽可能存在刺激效应和抑制作用[9]。低剂量的重金属会使植物产生保护反应，促进植物生长；而随着植物体内富集量的增加会对植物生长形成抑制效果。不同的植物对不同重金属元素有不同的抗性特征，所以只有把污染源的重金属成分与含量确定，然后对应地选择试验效应好的植物，并因地制宜综合考虑后才能最大程度地治理污染。

植物品种的选择和培育试验成为筛选植物进行污染土壤修复及污染地区环境美化的前提。研究表明，重金属在土壤中达到一定量时会对植物的生长产生影响[10-11]，且这种影响存在剂量效应[12]和差异性。波斯菊(Cosmosbipinnata)又名秋英，菊科英属，1年生植物，花期为30～60 d，应用广泛，多见于花坛、花镜之中[13]。研究表明,菊科植物具有较强的抗重金属污染能力和重金属元素富集能力，研究Cd胁迫下波斯菊种子萌发以及幼苗生长、生理、富集的状态，了解其耐受能力及致死浓度，对修复Cd污染土壤有重要的理论和实践意义。目前,在修复植物种类的选择、品种抗性、不同重金属元素及其混合浓度对不同地被植物发芽生长的影响和阈值的确定等方面研究较少，难以为城市园林绿化提供参考依据。直接播种相较于成株移栽菊具有成本低、绿化周期长、易打理等优势。本研究以模拟直接播种的方式，分析不同质量浓度Cd对波斯菊植物种子萌发、幼苗耐性及富集的影响，旨在为Cd污染地区土壤修复提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为购买自吉林省长春市绿友园林公司的波斯菊种子。

1.2 试验方法

依据中华人民共和国国家土壤环境质量标准(GB 36600—2018和GB 15618—2018)以及预试验所得结果，设置Cd质量浓度为0[对照(CK)]、0.3、3.0、20.0、60.0、120.0、180.0、240.0 mg/L，分别记为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8。Cd2+供源由分析纯CdCl2·2.5H2O配制所得，将Cd2+以溶液的形式加入到PC培养皿中，模拟土壤受到不同程度的重金属污染。在超净工作台内，每份试材选取50粒籽粒饱满、大小均一的种子，整齐摆放在垫有双层滤纸且已灭菌的PC培养皿中，每个培养皿中添加8 mL不同质量浓度梯度的Cd2+溶液，以添加8 mL无菌水为CK，进行单因素试验。为模拟植物在不同质量浓度Cd胁迫下土壤中的生长状态，不再补充额外Cd2+溶液。试验在模拟最优自然生长环境的人工气候箱中进行，温度设置为(19±4)℃，相对湿度设置为50%～90%，光照设置为0～6 000 lx，24 h暗处理后，培养7 d，重复3次。

1.3 测定指标与方法

每隔24 h记录一次种子的萌发数(以胚根露出种皮2 mm作为发芽标准)，计算种子发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、芽长抑制指数。待发芽终期结束后，选取各处理平均长势的茎与根，利用EPSON Expression 11000XL进行形态扫描，采用WinRHIZO 2016根系测量分析软件测定幼芽茎长(芽长)、根长、根表面积、根体积。将发芽率、根长、根表面积、根体积、芽长抑制指数、根长抑制指数与Cd质量浓度进行回归分析，探讨种子萌发、幼苗生长过程中对Cd的抗性能力。分别设定发芽率、根长、根表面积、根体积为对照50%和0所对应的Cd质量浓度为波斯菊种子萌发、根长、根表面积、根体积的临界质量浓度和极限质量浓度；分别设定芽长抑制指数、根长抑制指数为对照50%和100%所对应的Cd质量浓度为波斯菊幼苗芽长抑制指数、根长抑制指数的临界质量浓度和极限质量浓度。

发芽率=前7 d发芽总数/供试种子粒数×

100%[14]；

发芽势=前4 d发芽总数/供试种子粒数×

100%[14]；

发芽指数(GI)=∑Gt/Dt，其中，Gt为 Dt相对应每天的发芽种子数，Dt为发芽时间[15]；

活力指数(VI)=GI×S，其中，GI为发芽指数，S为试验终期正常幼苗长度[15]；

芽(根)长抑制指数=(对照长度-处理长度)/对照长度×100%[16]。

波斯菊幼苗中可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法；过氧化物酶(POD)活性测定用愈创木酚法；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT光还原法[17]。

波斯菊幼苗中Cd富集量的测定：将植株种皮摘掉，冲洗3次后用干燥滤纸吸掉植株表面的水分，每处理使用分析天平取10 g，剪碎后装在聚四氟乙烯消解管中，编号。加入5 mL硝酸浸泡过夜，第2天消解前加入0.5 mL高氯酸，然后先用石墨消解仪180 ℃消解45 min，再将温度升高到220 ℃继续消解到黄棕色烟雾完全冒尽，加入2 mL过氧化氢，继续加热到白烟冒尽，溶液透明，消解结束后冷却到室温，定容至25 mL,摇匀。使用原子吸收分光光度计测定溶液浓度。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0、Word 2013对数据进行Duncan氏新复极差法显著性分析、数据整理与图表制作。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对波斯菊种子萌发的影响

发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数是种子萌发的重要指标，是评价种子活力、特性、抗性、发芽速度、整齐度与生物量的综合反应。由表1可知，随着Cd胁迫质量浓度的增加，波斯菊种子发芽率先差异不显著，在A2处理达到峰值86.00%，A4处理开始极显著降低，A8处理时发芽率为0。发芽势与发芽率状态相似，发芽势先差异不显著，A2处理达到峰值78.00%，A5处理开始极显著降低，A8处理发芽势为0。波斯菊种子发芽指数先差异不显著，在A2处理达到峰值28.13，A4处理开始极显著降低，A8处理发芽指数为0；活力指数在A2处理时达到峰值373.71，A3处理之后呈现极显著的下降，A6、A7处理差异不显著，A8处理时活力指数为0。

表1 不同质量浓度Cd胁迫对波斯菊种子萌发的影响

注：数据为平均值±标准差；同列数据后不同大、小写字母分别表示差异极显著 (P<0.01)、显著 (P<0.05),表2、4同。

Note：The data are the mean ± standard deviation;Different capital and lowercase letters after the same column data indicate that the differences are extremely significant(P<0.01),significant(P<0.05),the same as Tab.2,4.

2.2 Cd胁迫对波斯菊幼苗生长的影响

由表2可以看出，A2处理波斯菊幼苗的芽长抑制指数为负值，对幼苗芽长的生长有促进作用，芽长较对照提高4.69%，但差异不显著，A3处理开始芽长抑制指数大于0，并随着Cd质量浓度增大，芽长抑制指数极显著增大，A8处理芽长抑制指数达到100.00%。A2处理波斯菊幼苗的根长抑制指数为负值，波斯菊幼苗根长、根表面积和根体积较对照分别提高5.33%、8.89%和6.52%，但是差异均不显著。A3处理开始根长抑制指数大于0，并随着Cd质量浓度增大，根长抑制指数先极显著增大，A5—A7处理虽然升高但不显著；根表面积先极显著下降，A6、A7处理开始根表面积下降不显著；根体积先显著下降，A6处理开始根体积差异不显著；A8处理根长抑制指数达到100.00%，根长、根表面积、根体积均为0，表现为完全抑制，各处理根系生长状态见图1。

表2 不同质量浓度Cd胁迫对波斯菊幼苗生长的影响

a—g：0、0.3、3.0、20.0、60.0、120.0、180.0 mg/L Cd图1 不同质量浓度Cd胁迫下波斯菊根系生长状态Fig.1 Growth status of Cosmos bipinnata roots under different mass concentrations of Cd stress

2.3 Cd胁迫对波斯菊种子萌发和幼苗芽根生长的浓度阈值的影响

如表3所示，波斯菊种子萌发的临界质量浓度和极限质量浓度均高于幼苗生长的重金属质量浓度，说明影响波斯菊种子萌发的临界质量浓度和极限质量浓度最高。波斯菊种子可以忍受较高质量浓度的Cd胁迫，但其幼苗只能忍受相对较低质量浓度的胁迫，并且幼苗根系的耐受性弱于幼苗芽茎。波斯菊幼苗根系指标根体积的临界质量浓度较低，与根长、根表面积的临界质量浓度相比分别降低16.03%和18.67%；根表面积的极限质量浓度较高，与根长和根体积的极限质量浓度相比分别升高13.79%和12.24%。

2.4 Cd胁迫对波斯菊幼苗生理指标的影响

2.4.1 可溶性蛋白含量 由表4可知，随着Cd胁迫质量浓度的增加，波斯菊可溶性蛋白含量总体呈现先升高再下降的趋势。A2处理比A1处理可溶性蛋白含量显著降低8.64%；A3处理比A1处理极显著升高10.91%；A4处理与A1处理相比较无显著差异；A5、A6、A7处理与A1处理相比均极显著下降，分别下降11.36%、33.64%、47.73%。0.3 mg/L Cd胁迫对波斯菊可溶性蛋白的形成有抑制作用，3.0 mg/L Cd胁迫对波斯菊可溶性蛋白的形成有促进作用，但随着Cd胁迫质量浓度的增加，对波斯菊幼苗可溶性蛋白形成从促进作用转为抑制作用，并逐渐增强。

表3 波斯菊种子萌发和幼苗生长与Cd胁迫质量浓度的关系 Tab.3 Relationship between seed germination,seedling growth of Cosmos bipinnata and Cd stress mass concentration

注：A.表示种子发芽率与Cd质量浓度的关系；B.表示种子根长与Cd质量浓度的关系；C.表示种子根表面积与Cd质量浓度的关系；D.表示种子根体积与Cd质量浓度的关系；E.表示种子芽长抑制指数与Cd质量浓度的关系；F.表示种子根长抑制指数与Cd质量浓度的关系。

Note：A.Indicates the relationship between seed germination rate and Cd mass concentration;B.Indicates the relationship between seed root length and Cd mass concentration;C.Indicates the relationship between seed root surface area and Cd mass concentration;D.Indicates the relationship between seed root volume and Cd mass concentration;E.Indicates the relationship between seed bud length inhibition index and Cd mass concentration;F.Indicates the relationship between seed root length inhibition index and Cd mass concentration.

表4 Cd胁迫对波斯菊幼苗生理指标的影响 Tab.4 Effect of cadmium stress on physiological index of Cosmos bipinnata seedlings

2.4.2 MDA含量 由表4可知，随着Cd胁迫质量浓度的增加，波斯菊幼苗MDA含量呈现先降低后升高再降低的趋势，A2与A1处理相比显著下降29.03%，A3处理随后上升，与A1处理差异不显著，A4、A5处理与A1处理相比极显著升高40.86%、64.52%，A6、A7处理较A5处理显著降低。低质量浓度Cd胁迫对波斯菊幼苗MDA生成抑制效果显著，随着Cd胁迫质量浓度的增加，先促进MDA生成，后又逐渐抑制。

2.4.3 抗氧化酶活性 由表4可知，随着Cd胁迫质量浓度的增加，POD活性先降低后升高再降低，A2处理POD活性与A1处理相比极显著降低29.76%；A3、A4处理与A1处理相比极显著上升180.90%、87.55%；A5、A6、A7处理与A1处理相比极显著下降，分别下降27.76%、52.03%、61.71%。SOD活性先降低后升高再降低，A2与A1处理无显著差异，A3、A4处理与A1处理相比极显著升高，分别上升22.98%和31.25%，A5、A6处理与A1处理相比无显著差异，A7处理与A1处理相比极显著下降29.19%。波斯菊幼苗POD与SOD活性表明，随着Cd胁迫质量浓度的增加，开始时对波斯菊幼苗POD活性的抑制作用较强，随后波斯菊幼苗POD活性突然升高，之后促进作用逐渐减弱转为抑制；随着Cd胁迫质量浓度的增加，对波斯菊幼苗SOD活性促进明显，随后逐渐抑制。

2.5 Cd胁迫对波斯菊幼苗富集指标的影响

从图2可知，Cd胁迫下波斯菊Cd吸收量随着Cd2+质量浓度的增加而逐渐增大，A2、A3处理与A1处理相比差异不显著，富集量分别为0.33、0.40 mg/kg；A4、A5、A6、A7处理与A1处理相比极显著升高，Cd含量分别达到6.57、19.03、28.97、47.83 mg/kg。波斯菊富集能力并未达到超富集植物标准，但耐Cd性强，生物量大也使波斯菊作为植物修复材料具有一定实际意义。

不同大、小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)

3 结论与讨论

植物耐Cd性大小由植物的遗传特性决定，其中与耐Cd性密切相关的是植物的发育情况和植物种类[18]。植物种子在Cd胁迫下能否正常发芽是植物能否生长的先决条件，种子发芽率、发芽势、根长、芽长、发芽指数和活力指数是评价植物种子萌发能力常用的生长指标，能反映种子发芽能力、发芽速度、发芽整齐度。

本试验结果表明，波斯菊的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数随着Cd质量浓度的增加均显著下降，波斯菊对于Cd胁迫有很强的抗性，即使在120.0 mg/L Cd处理这样的高质量浓度胁迫下发芽率依然是对照的57.04%，足以看出波斯菊的耐Cd能力较强，是一种良好的修复被Cd污染土壤的植物材料，波斯菊种子发芽期对重金属Cd的胁迫耐受能力较强，在Cd污染的土壤治理中具有很大的应用潜力，这与蒋兴一等[19]的研究结论相一致。相同Cd胁迫处理下，波斯菊种子发芽的根长、芽长和根长抑制指数、芽长抑制指数的敏感程度和抑制程度不同，说明植物的种子萌发中芽与根对不同质量浓度的重金属Cd胁迫的响应速度是不同的，且根大于芽。随着Cd质量浓度的增加，波斯菊的根长、芽长和根表面积、根体积均呈先上升后下降的变化趋势，这与廖钢等[20]、白瑞琴等[21]的研究结论一致，Cd的毒害作用引起根芽损伤，抑制光合与蒸腾作用。其上升段虽然差异不显著，但是结合A2处理芽长抑制指数和根长抑制指数皆为负值，可以说明低浓度的Cd胁迫对于波斯菊发芽时的根长和芽长生长是有促进作用的；但是随着浓度升高逐渐转为抑制作用而且不断增强，这与于何淼等[22]的研究结果相一致，即土壤中Cd浓度越大，对种子萌发的抑制作用越大，当Cd浓度达到一定量时，幼苗生长受到严重抑制而表现出未长现象。

较少量的重金属Cd元素对植物的生长生理过程存在积极的作用，本试验中低质量浓度的Cd胁迫对波斯菊种子的萌发起促进作用，但是随着Cd质量浓度的升高，促进作用逐渐减弱，即Cd对一些植物生长存在剂量效应，在一定浓度范围内，Cd能促进植物的生长[23]。何俊瑜等[24]以水稻为材料、张玲等[25]以小麦为材料进行Cd胁迫试验，也得出了相近的结论，即一定浓度的Cd胁迫可以促进某些植物种子发芽生长。

植物种子的生理变化情况对于研究植物种子受胁迫的耐性特征具有很大映射作用，可溶性蛋白含量、MDA含量、POD活性、SOD活性是必不可少的观测指标。本试验结果表明，A2处理可溶性蛋白含量、POD活性和MDA含量较对照均显著降低，而SOD活性变化不大，说明波斯菊种子正在处于应激状态，对代谢有所影响，但影响不大。可溶性蛋白含量和POD活性在A3处理时数值最高，这与韩淑梅等[26]提出重金属胁迫可使可溶性蛋白含量增加、植物体内会形成多肽来抵抗重金属毒害的结果相一致。A5处理时MDA含量达到最高，A4处理SOD活性达到最高，波斯菊对Cd胁迫有较强的抗性，在A4处理时，抗性最强，而在A7处理时，SOD活性还在一个相对较高的水平，说明波斯菊的耐Cd性很强，这与刘周莉等[27]的研究结果一致，与张军等[28]、宋瑜等[29]提出的在Cd胁迫下，植物可以通过络合解毒机制、硫代谢响应、抗氧化系统对活性氧的清除作用等对策提高对Cd耐性的研究结果一致，植物通过体内保护酶系统清除或减少逆境胁迫所产生的活性氧,避免其对组织细胞的伤害,从而表现出氧化胁迫的抗性。

本试验中，中低浓度的Cd胁迫会激发SOD活性，使其活性增加；高浓度Cd胁迫使SOD活性降低。可能是因为SOD受到H2O2等衍生物的抑制，并且Cd胁迫破坏了SOD分子结构,导致活性氧的清除能力降低，从而使植物的抗性下降，最终导致伤害的发生。说明SOD活性的增强是波斯菊抗Cd胁迫产生过氧化伤害的主要机制之一。

波斯菊是一种良好的用于Cd污染地区土壤植物修复的材料，具有较强的耐Cd性，在低质量浓度Cd胁迫下对波斯菊生长有一定的刺激作用，对波斯菊种子的发芽是有促进作用的；在中低质量浓度Cd胁迫下，波斯菊表现出较强的抗Cd性，波斯菊可以通过调整自身的某些机能来抵抗Cd胁迫的危害，使种子不受强烈的Cd胁迫影响，从而接近正常状态生长；在更高质量浓度Cd胁迫下，波斯菊种子表现出了较强的耐Cd性。波斯菊能在城市Cd污染土壤修复中发挥积极作用，耐Cd性强，生物量大，作为植物修复材料具有一定实际意义，建议因地制宜，积极采用。