一种PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株新方法的建立

邢楣 符林琳

重症患者多为免疫力低下，抵抗细菌能力较低，长时间的住院治疗，易出现院内感染的问题，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的感染[1]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）具有坚实的细胞壁，其对高温及干燥具有很强的抵抗力的一种革兰阳性球菌，80℃的条件下持续加热30 min 才可能被杀灭[2]。19世纪60年代，世界第一例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的患者在英国被发现[3]。在甲氧西林金黄色葡萄球菌中存在一种与β-内酰胺类抗生素低亲和力结合蛋白PBP2a，而甲氧西林敏感葡萄球菌中并不具有这一蛋白[4]。研究发现，这种蛋白是由mecA基因编码表达的存在于甲氧西林敏感葡萄球菌细胞的表面，对β-内酰胺类抗生素有极低的亲和力[5]。而mecA基因对于SA 耐药性的产生具有至关重要的作用，细菌细胞之所以会产生耐受是由于PBPs 会被这种mecA基因编码表达的蛋白抑制，从而使细菌在β-内酰胺类抗生素存在时不能发挥正常生理功能。PBP2a 可代替被抑制的PBPs 发挥作用，进而促使细菌得以生存。根据2011年美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐，可通过mecA基因的检测确认甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）[6]。而既往比较常用的MRSA 检测方法主要为纸片扩散法，但随着研究的断深入，有研究发现，由于金黄色葡萄球表达情况的各不相同，纸片扩散法存在较大误差[7]。基因聚合酶链反应（PCR）法被公认为临床金黄色葡萄球菌检测的标准[8]，但关于该实验方法与纸片扩散检查法的临床综合价值比较尚未明确。本试验主要通过分析不同检测方法对MRSA的检出情况，旨在探讨一种适合医院检测MRSA的简便而可靠方法。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集2016年1月至2018年12月入住本院重症加强护理病房（intensive care unit，ICU）的重症患者的脓液、分泌物、血液等标本中分离培养病原菌株，且均为初次分离所得，所有菌株均来源于不同患者。

1.2 实时荧光PCR检测

取样本液体1 mL，10 000 rpm 离心后去除上清液后，将事先配制好20 μg/mL 的溶葡萄球菌酶加入到刚离心后的菌体沉淀中，震荡器中震荡后，待混合均匀后放置在水浴箱中静置1 h，保持水温在37℃，并注意随时观察离心管中的菌液是否会出现浑浊。待浑浊后，分别加入20 μL Proteinase K 溶液和220 μL 的GB 缓冲液，放在微型混合器上进行充分震荡后，将其置于70℃的干式金属浴恒温器中，10 min 后，待溶液澄清透亮后，再加入220 μL 的无水乙醇，在微型混合器上充分震荡后，待管内出现浑浊并伴随着絮状样沉淀物出现后进行离心，将上清液保存于-20℃备用[5]。然后根据耐甲氧西林mecA基因及NUC基因的保守区域来进行引物和TaqMan 探针的设计由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列为上游引物：5′-TAGTTGTAGTTGTCGGGT-3′，下游引物：5′-TATCGACGTTCAGTCAT-3′）并经BLAST 来检验引物和探针的特异性。最后将提取的核酸进行PCR 荧光检测，并将荧光进行收集，扩增条件为94 ℃3 min 1个循环，93 ℃30 s、55 ℃45 s，40个循环[9]。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌鉴定的标准[10]见表1。

表1 快速检测MRSA结果判读标准Table1 Rapid detection of MRSA results interpretation criteria

1.3 纸片扩散法

头孢西丁及苯唑西林纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B法）均根据CLSI 的标准来进行试验[10]。质控菌株为ATCC26859，苯唑西林琼脂稀释法质控菌株为ATCC25399。MH 及羊血培养基规格9 cm（江门凯林生产）。头孢西丁扩散纸片及苯唑西林扩散纸片的规格均为30 μg（OXOID 生产）。纸片扩散法步骤：选取纯培养的菌落将其配制成0.5 麦氏单位的菌悬液，15 min 内将校正过浓度的菌液接种完毕[11]。判断标准[8，12]：金黄色葡萄球菌：头孢西丁纸片上的抑菌圈＞22为敏感，否则为耐药。苯唑西林纸片，抑菌圈的直径＞12 mm为敏感，否则为耐药。它的凝固酶阴性葡萄球菌，头孢西丁纸片抑菌圈＞25 mm为敏感，否则即为耐药，唑西林纸片抑菌圈直径＞15 mm为敏感，否则为耐药。微量琼脂稀释法：用Microscan 细菌鉴定仪测定苯唑西林最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），判断标准遵循临床实验室标准化委员会制定[13]：MIC＞4 μg/mL为MRSA。

1.4 药敏试验及耐药性分析

采用API 或全自动微生物分析仪（VITEK）鉴定系统（法国生物梅里埃公司）鉴定[14]。细菌敏感性测定采用纸片扩散法（K-B法）。药敏试验：参照《全国临床检验操作规程》（第三版）[15]进行。

2 结果

2.1 实时荧光PCR检测mecA 方法和纸片扩散法检测结果的比较

43 株金黄色葡萄球菌中实时荧光定量PCR 方法检测到11例耐药金黄色葡萄球菌阳性，其中头孢西丁K-B 法与苯唑西林K-B 法中检测出的耐药金黄色葡萄球菌病例均在实时荧光PCR检测的结果中，见表2、图1。

表2 实时荧光PCR检测mecA 方法和纸片扩散法检测结果的比较Table2 Comparison of real-time fluorescent PCR method and paper diffusion method to detect mecA gene

图1 样本中mecA 基因实时荧光PCR检测结果Figure1 Results of real-time fluorescent PCR detection of mecA gene in the sample

2.2 耐甲氧西林菌株样本中耐甲氧西林金葡菌的检测结果

11例耐甲氧西林mecA基因阳性的样本中NUC基因阳性2例，这样不仅具有耐甲氧西林mecA基因还具有NUC基因的即为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。见表3、图2。

表3 耐甲氧西林菌株样本中耐甲氧西林金葡菌的检测结果Table3 Test results of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in methicillin-resistant strain samples

图2 样本中NUC 基因实时荧光PCR检测结果Figure2 Results of real-time fluorescent PCR detection of NUC gene in the sample

2.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性分析

以mecA基因检测呈阳性为“金标准”，所有耐甲氧西林金葡萄球菌对青霉素和苯唑西林均表现出极强的耐药性，而在红霉素和克林霉素中耐药性较青霉素稍弱，对万古霉素、替加环素、利奈唑胺、利福平均表现为敏感，对四环素、庆大霉素等具备一定的敏感性，见表4。

3 讨论

金葡菌容易引起乳腺炎、痈、感染性休克、脓毒血症等常见疾病[16]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产生主要是由于金黄色葡萄球菌获得了一种外源性插入到MRSA的基因片段-mecA基因，这种基因片段能够编码产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP）2a[17]。传统的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法为苯唑西林纸片扩散法及MRSA 筛选试验等，这些方法只能筛选出部分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其准确度不能达到100%[18]。mecA基因对于SA 耐药性的产生有着至关重要的作用，同时mecA的表达会受到遗传背景等很多相关因素的影响，因此获得性mecA葡萄球菌的耐药水平从敏感到耐药具有很大差异[19]。检测金黄色葡萄球菌上的mecA基因，可作为MRSA 感染观测的一项分子标记[20]。

表4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性分析Table4 Analysis of drug resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus

根据以往的研究[21]可知，PBP2a 表达量的降低苛刻解除mecl 蛋白对mecA基因的抑制作用，从而促使mecA活化，进而对苯唑西林耐药。故患者在治疗中应避免使用一内酰胺类抗生素，减少其耐药机会。而在本研究中，采用实时荧光PCR 方法检测法准确度高于头孢西丁及苯唑西林纸片扩散法，且所有耐甲氧西林金葡萄球菌对青霉素和苯唑西林均表现出极强的耐药性，而对红霉素和克林霉素中的耐药性较青霉素稍有降低，对利奈唑胺、替加环素、万古霉素、利福平均表现为敏感。由此可见，及时明确耐甲氧西林金葡萄球菌存在并分析其药敏情况制定正确的治疗方案对患者具有极为重。结合以往研究[22]和本组资料认为，实时荧光定量PCR 较传统检查方法检测具有更加快速和准确的特点，且本组研究中所使用的利用实时荧光定PCR的方法设计了针对mecA基因的引物和Taqman 探针，以快速而特异的检测，引起金黄色葡萄球菌对甲氧西林等β-内酰胺类抗菌药物耐药的基因mecA。通过对各指标和条件的优化使检测过程中的反应体系和反应条件均达到最佳。且有研究[23-24]显示，在实时荧光定量PCR检测过程中，实时荧光定量PCR 可以在PCR 反应过程中直接检测荧光信号，无需配胶、电泳等步骤，可以更加快速有效地鉴别出MRSA，且可以对靶位基因进行定量检测，由此更高程度地提高了检测结果的准确性。

综上所述，在采用mecA基因作为目标基因检测出的耐甲氧西林葡萄球菌基础上，再以金黄色葡萄球菌特异性凝固酶基因NUC基因特异性引物探针检测来测定。与头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林纸片扩散法相比较而言，前者检测其是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的准确度更高，特异性更好，能够更准确检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，值得进一步研究推广。