骨髓间充质干细胞-生物蛋白胶在关节软骨缺损修复中的作用研究

余杰锋，邝立鹏，张 炜，姚泽明 [遵义医科大学第五附属(珠海)医院，广东 珠海 519100]

最近几年，新研发的软骨组织工程技术，对于软骨兔关节细胞的缺损修复有了新的方案与想法，对于当前这种技术成为软骨缺损修复的重点研究对象，软骨缺损后重新生成可能变成一种现实[1]。本研究拟通过兔自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)与自体提取生物蛋白胶复合后是否可以使兔膝关节软骨缺损部分有效恢复，并观察其远期的修复效果,这可能会使得修复软骨组织细胞的来源变得更加方便，寻找合理的实验支架材料，并为软骨组织工程技术的临床应用提供实验基础和依据。

1 资料与方法

1.1研究对象：饲养材料与动物的选取：饲养48只普通级别的雌性或者雄性新西兰兔，体重为1.4～1.5 kg,饲养时的温度维持在25℃左右，保持湿度约为60%，能够让它们自由的活动与饮食，每只兔子都单独在一个笼子里饲养，定时进行杀菌和更换饲料水，清理完它们的排泄物，保持好饲养笼子的干燥。清洁对兔子的饲养以及所有的实验操作，受到了国家动物管理局的认可，同时也并不违反伦理[2]。广东省的一家动物实验中心配置了对实验兔子的常规饲养食物。

1.2方法

1.2.1BMSCs 提取、 纯化和鉴定：用合理科学的方法将兔BMSCs分离出来，依据细胞形状的改变情况和查看细胞表面的物质进行鉴定。对于体外培养的干细胞进行同样的观察与检测，观察其成软骨、成骨、成脂的分化能力。

1.2.2兔自体血液的获取及生物蛋白胶的制备：抽取兔动脉血后送第三方生物制剂公司进行蛋白胶提取。

1.2.3兔BMSCs与蛋白胶复合的培养及观察。

1.2.4兔膝关节软骨全层缺损动物模型的分组:按随机分配原则将饲养的48只新西兰兔均分为4个小组,每组12只,每组有24个膝关节样本,分别进行4种不同的处理:1组将软骨切除后再原位进行回植;2组将BMSCs与关节软骨脱细胞基质复合物修复软骨缺损;3组单纯用脱细胞软骨基质修复缺损;4组为软骨部分缺损处不做任何处理。以上各组动物按照严格无菌原则操作,进行实验后3 d再用青霉素注射，避免被细菌感染,周期性的处理实验切口。

1.3术后观察指标

1.3.1术后观察兔子的基本生活情况:每天检查实验后兔子的走路情况、精神变化、身体姿势、伤口恢复情况、饮食情况、走动情况[3-4]。

1.3.2大体标本观察:在进行实验后的4周、8周、12周内在每一小组中减少4只兔子。大体查看兔子包括关节面在内的左股骨远段。用眼睛看软骨缺损修复变化情况,包括软骨缺损修复程度，修复组织是否是透明软骨及其色泽，与周边组织及软骨下骨的整合度，有无裂缝及硬化，有无骨赘形成及滑膜反应等并拍照。根据改良的Pineda法评分标准评分[5]。

1.3.3标本组织学检测：常规HE染色观察修复组织的一般情况，用甲苯胺蓝测来检测糖胺多糖,用Ⅱ型胶原免疫组化染色来检测Ⅱ型胶原。

1.3.4术后每天对其双侧膝关节活动度进行对比测定。

2 结果

2.1各组术后观察指标情况：术后4周,1组原位回植软骨基本存活,2组中软骨缺损修复大体已经完成,3组和4组能看到软骨还有一些凹凸;2组软骨修复后显现黄色，且颜色很浅，HE染色可以看到一点幼稚软骨细胞,且细胞排列很乱,周围未见典型的陷窝样结构,可以看到少许基质。实验后8周,3组软骨细胞修复基本完成,4组还见小凹陷。2组缺损处修复组织较前增多,颜色呈淡黄色,表面较4周时光滑,弹性充足,与旁边的软骨组织分界仍旧存在。实验12周后1组缺损恢复效果达到与正常一样,2组缺损恢复过程中出现了颜色变化,与正常软骨组织的质地表现一样,HE染色后的软骨细胞,有着异常的排列方式，软骨表面有凹陷。3组、4组缺损区基本上都被纤维细胞所围住,颜色呈现深灰白色,很软的质地,与旁边的正常软骨细胞有着清晰的边界。

2.2各组各时间点组织切片Wakitani评分:定时通过Wakitani 评分表对实验结果进行组织学评分,1组、2组在每个时间的修复效果都比3组、4组更好,差异有统计学意义(P<0.05)，表示其恢复效果差别很大;3组、4组这两个小组对相同实验时间的兔子软骨组织恢复效果进行分析，差异无统计学意义(P>0.05)。2组在不同的时间内与其他组的分析比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别时间 细胞形态 与周围结合软骨厚度基质染色 总分 1组第28天1.1±0.81.3±0.11.0±0.11.3±0.36.1±1.4第56天0.8±0.10.5±0.10.4±0.80.6±0.63.4±0.4第84天0.3±0.30.6±0.30.3±0.50.3±0.31.1±1.72组第28天1.3±0.11.3±0.11.5±0.11.4±0.45.0±1.5第56天0.7±0.40.6±0.20.7±0.40.5±0.03.1±0.3第84天0.2±0.50.3±0.50.5±0.10.4±0.31.4±1.03组第28天2.1±0.31.3±0.41.6±0.41.9±0.58.0±1.9第56天1.7±0.51.1±0.11.3±0.11.7±0.65.1±0.7第84天1.3±0.60.8±0.61.4±0.01.1±0.73.2±1.84组第28天3.1±0.42.5±0.32.3±0.42.8±0.311±1.1第56天2.3±0.81.7±0.11.9±0.12.5±0.113.7±0.4第84天2.1±0.41.3±0.41.9±0.32.1±0.48.7±1.8

注：每组各时间点关节数量均为8个

3 讨论

软骨组织缺损是一种有着较高病发率的骨科疾病[6]。关节软骨缺损分为两种类别，分别是部分缺损和全层缺损[7]。关节软骨部分缺损对下骨组织不会产生影响。本次研究对BMSCs进行分析，研究复合关节软骨脱细胞基质在修补兔关节软骨部中的原理和作用机制,结果显示可以生产软骨样组织修复缺损部位。而单独应用脱细胞软骨基质修复缺损部位生成的为纤维组织。软骨细胞在体内可以由BMSCs诱导形成。随着关节软骨损伤的研究越来越深入,将会被广泛应用于医学。组织工程技术对骨损伤修复提出重要方案和思路。