QuEChERS/UPLC-MS/MS法同时测定梅花鹿鹿鞭中18种磺胺

黄胜广 王玉方 赵卉

摘要 [目的]采用分散固相萃取的前处理技术，建立了一种UPLC-MS/MS（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry）法同时测定梅花鹿鹿鞭中18种磺胺的检测方法。[方法]鹿鞭样品以乙腈为提取剂，100 mg PSA、150 mg C18与50 mg中性氧化铝为净化剂。液相色谱条件：ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A为25 mmol/L甲酸乙腈，B为水，柱温35 ℃;质谱条件：正离子模式（ESI+），多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。鹿鞭中磺胺含量采用外标法定量。[结果]18种磺胺在0.05～50.00 ng/mL线性关系良好，决定系数R2均大于0.999，18种磺胺的检出限（LOD）为0.05 μg/kg，定量限（LOQ）为0.15 μg/kg。18种磺胺的平均加样回收率为83.5%～97.7%，RSD均小于5%。[结论]该方法具有操作简便、净化效果显著、灵敏度高、准确性好、检出限低等优点，可用于梅花鹿鹿鞭中18种磺胺的检测。

关键词 QuEChERS;UPLC-MS/MS;梅花鹿;鹿鞭;磺胺

Abstract [Objective]A method for the simultaneous determination of 18 sulfonamides in deer whip of Cervus nippon Temminck by UPLCMS/MS was developed by using the pretreatment technology of dispersed solid phase extraction. [Method]Deer whip samples were extracted with acetonitrile and purified with 100 mg PSA， 150 mg C18 and 50 mg neutral alumina. The UPLC analysis was carried out by a 35 ℃ thermostatic Waters Acquity UPLC BEH C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with a mobile phase composed of 25 mmol/L formic acid acetonitrilewater for gradient elution at 0.3 mL/min. The detection was carried out on MS/MS with ESI in positive ion in the multiple reaction monitoring mode .The content of sulfonamides in pilose deer whip was quantified by external standard method.[Result] 18 kinds of sulfonamides had a good linear relationship between 0.05-50.00 ng/mL， the determination coefficient R2 were all greater than 0.999， LOD of 18 kinds of sulfonamides was 0.05 μg/kg， LOQ was 0.15 μg/kg. The average recovery of 18 sulfonamides was 83.5%-97.7%，RSD was less than 5%. [Conclusion]The method has the advantages of simple operation， remarkable purification effect， high sensitivity， good accuracy and low detection limit. It can be used for the determination of 18 sulfonamides in deer whip of Cervus nippon Temminck.

Key words QuEChERS;UPLCMS/MS;Cervus nippon Temminck;Deep whip;Sulfonamides

鹿鞭（Penis et Testis Cervi），又名鹿腎、鹿冲，系鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）、马鹿（Cervuselaphus L.）的干燥带睾丸的阴茎，其味甘、咸，性温，具有补肾壮阳、固精益血的功能，可用于治疗过度劳累所导致的身体损伤、腰酸腿痛、肾脏精气阴阳不足、耳鸣、阳疹、宫冷不孕等症[1]。磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是由化学合成的一类抗生素，主要用来预防和治疗细菌感染性疾病，具有稳定的化学性质、抗菌高效、低毒、价格便宜和使用方便等优点而被广泛应用到畜牧业上，并越来越受到养殖户的重视。但磺胺类药物在动物体内代谢时间较长，食用含有磺胺类药物的动物产品易在人体内蓄积， 当蓄积浓度超过一定值时会对人体健康产生危害[2]。人长期摄入含磺胺类药物的动物性食品后，药物不断在人体内蓄积，损害肾脏、耐菌株大量繁殖、破坏肠胃道微生物平衡等[3]。国际食品法典委员会和欧盟等规定食品中的磺胺总量不能超过100 μg/kg，我国农业农村部235号文件中规定磺胺类药物的总残留量最高为100 μg/kg[4]。

目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有气相色谱-质谱法（GC-MS）[5-6] 、高效液相色谱法（HPLC）[7-10] 、毛细管电泳法[11-13]、酶联免疫分析法[14-16]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）[17-20]等。HPLC法灵敏度低，抗干扰能力差;GC-MS法样品需经衍生化处理，操作复杂;毛细管电泳法由于进样量少，因而制备能力差，灵敏度较低;酶联免疫分析法重复性较低、稳定性较差以及存在交叉反应等;UPLC-MS法具有选择性强、灵敏度高、检测限低等优点，是目前最常采用的兽药残留的检测方法。

QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe），是近年来国际上最新发展起来的一种快速检测的样品前处理技术，具有快速、准确、高效的特点[21-23]。目前，QuEChERS结合UPLC-MS法测定鹿鞭中磺胺类药物的检测方法鲜见报道。该研究采用QuEChERS法提取鹿鞭中的磺胺类药物，以PSA、C18和中性氧化铝为净化剂，优化了最优提取和净化条件，并通过UPLC-MS/MS以外标法对市售鹿鞭中的18种磺胺进行了含量测定，以期为鹿茸的质量评价研究提供了坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。

超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（XEVO TQ-MS质谱仪，美国Waters公司）;多样平行蒸发仪（Syncore101，瑞士步琪公司）;超纯水器（美国Milli-Q Advantage A10）;电子天平（XS205DU，梅特勒-托利多公司）;高速冷冻离心机（Sigma3-30k，德国）;涡旋振荡器（Multi-Tube Vortexer）;超声波清洗仪（上海易净超声波仪器有限公司）。

1.1.2 试剂。

甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯，均购于赛默飞世尔科技公司，纯度均大于99.99%;PSA（乙二胺基-N-丙基）粉末、C18粉末、中性氧化铝粉末，40～63 μm，分析纯，上海安谱科技股份有限公司;无水硫酸钠、氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司;磺胺醋酰（sulfacetamide）、磺胺吡啶（sulfapyridine）、磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺二甲恶唑（sulfamoxol）、磺胺异恶唑（sulfisoxazole）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole）、磺胺苯酰（sulfabenzamide）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、磺胺氯哒嗪（sulfachloropyridazine）、磺胺喹恶啉（sulfachinoxalin）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadoxine）、磺胺间二甲氧嘧啶（sulfadimethoxypyrimidine）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole），纯度均98%以上，德国Dr.Ehrensorfer公司;超纯水由超纯水机制备，电阻率≥18.25 MΩ。

1.1.3 试材。梅花鹿鹿鞭样品采集自吉林省，共计60根，将鹿鞭样品进行编号，切片，置于100 ℃烘箱中烘24 h，粉碎，保存于4 ℃的冰箱中待测。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制。

精密称取各磺胺标准品10.0 mg（精确到0.1 mg）置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成200 μg/mL的混合标准品溶液，于4 ℃保存。

1.2.2 供试品溶液的制备。

1.2.2.1 提取。

准确称取鹿鞭样品1.0 g（精确到0.01 g），置于50 mL玻璃试管中，加入10 mL乙腈，漩涡2 min，使其充分混匀，置于超声仪中超声提取20 min后，静止3 min后，将提取液倒入50 mL聚丙烯离心管中，殘渣中加入10 mL乙腈重复上述步骤提取2次，合并提取液，置于离心机中，10 000 r/min离心10 min，取上清液，于蒸发仪中蒸发近干，待复溶净化。

1.2.2.2 净化。

加5 mL的甲醇-水（1∶1，V/V）复溶，加10 mL正己烷除脂，涡旋混匀，静置待分层后取下清液转移到装有100 mg的C18、100 mg PSA和50 mg中性氧化铝的10 mL离心管中，涡旋5 min充分混匀，置于4 ℃的离心机中，以15 000 r/min离心15 min，取上清液经0.22 μm水系滤膜超滤后上机测定。

1.2.3 色谱条件。

色谱柱为ACQUITYBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱温为35 ℃;流速为0.3 mL/min;进样量3 μL;流动相A为25 mmol/L甲酸乙腈，B为水。梯度洗脱程序见表1。

1.2.4 质谱条件。

电离方式：正离子模式（ESI+）;扫描方式：多反应监测（MRM）;毛细管电压：3 kV;离子源温度：150 ℃;脱溶剂温度：450 ℃;碰撞气流量：0.19 mL/min;脱溶剂气流量：1 000 L/h。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择与优化

试验对乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷4种提取溶剂进行考察，结果表明（图1），以强极性的甲醇为提取溶剂时，浓缩后瓶上附着有大量蛋白质变性产物，形成较大的颗粒状物质，复溶时无法除尽，说明颗粒状物质包裹了目标物，致使回收率下降;用正己烷、乙酸乙酯提取时，净化后有较多絮状脂肪难于分离沉淀，不利于过膜超滤;乙腈为提取溶剂时，能很好地分离沉淀蛋白质和脂肪，18种磺胺的回收率均高于甲醇、正己烷、乙酸乙酯。因此试验以乙腈作为提取剂。

2.2 提取条件的选择与优化

黄胜广等[24]研究发现以玻璃试管为容器对目标物的提取有利，试验对超声时间（5、10、15、20 min）进行考察，结果发现（图2），以20 min提取效果最好。

2.3 净化剂的选择与优化

常用的净化剂有PSA、C18、中性氧化铝、石墨碳化黑和无水硫酸镁等。无水硫酸镁常用于吸附水分，石墨碳化黑可以有效地去除色素，对鹿鞭中的脂类无净化作用;PSA和C18都能除去基质中的脂肪、蛋白质，中性氧化铝可以除去一部分的脂肪。该试验采用分散固相萃取技术进行净化，根据鹿鞭的主要成分及目标物的性质，以PSA（100、150、200 mg）与C18（100、150、200 mg）、中性氧化铝（50 mg）组合，通过加样回收率考察最优净化条件。结果表明（图3），以100 mg PSA、150 mg C18、50 mg中性氧化铝净化时为最优净化条件，18种磺胺的回收率为86.4%～106.5%，均能满足试验需求。随着PSA用量的增加、C18超过150 mg，18种磺胺的回收率反而降低，这可能是过量的PSA、C18会吸附一部分的磺胺，致使回收率降低。

2.4 质谱条件的优化

根据磺胺类药物的结构，通过正离子、负离子扫描模式对比发现，[M+H]+产生的子离子丰度相对稳定，响应值比较高，保证了定量结果的准确性。采用针泵连续直接进样，选择[M+H]+为母离子进行调谐，分别对碰撞电压、锥孔电压等条件进行了优化，具体参数见表2。

2.5 色谱条件的优化

试验考察了乙腈-水、25 mmol/L甲酸乙腈-水、乙腈-25 mmol/L甲酸水3种流动相，结果发现（图4），以25 mmol/L甲酸乙腈-水按“1.2.3”条件下洗脱时，18种磺胺的响应值高、干扰少、峰形好、检出限低，因此最终选定25 mmol/L甲酸乙腈-水为流动相。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系、检出限和定量限。

将混合标准品溶液用甲醇进行梯度稀释，配成浓度为0.025、0.05、0.075、0.25、0.5、1、2、5、10、25、50 ng/mL的混合标准品溶液，以峰面积（Y）为纵坐标、标准品浓度（X）为横坐标绘制标准曲线。将18种磺胺混合对照品溶液用甲醇逐级稀释后，以信噪比（S/N）的3倍的溶液浓度为检出限（LOD），S/N的10倍的溶液浓度为定量限（LOQ）。18种磺胺的回归方程、线性范围、 检出限和定量限见表3。从表3可以看出，18种磺胺在0.05～50.00 ng/mL线性关系良好，决定系数R2均大于0.999，18种磺胺的LOD为0.05 μg/kg，LOQ为0.15 μg/kg。

2.6.2 精密度试验。

精密吸取10 ng/mL的18种磺胺混合对照品溶液3 μL，按“1.2.4”质谱条件和“1.2.3”色谱条件进样分析，连续进样6次，测定峰面积，计算18种磺胺的RSD。结果表明，18种磺胺的峰面积RSD为3.2%～4.8%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验。

精密称取1.0 g鹿鞭样品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、48 h按“1.2.3”色谱条件和“1.2.4”质谱条件进样分析，每次进样3 μL，测定峰面积，计算18种磺胺的RSD。结果表明，18种磺胺的峰面积RSD为2.9%～4.5%，表明仪器稳定性良好。

2.6.4 重复性试验。

称取同一鹿鞭样品6份，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，按“1.2.4”质谱条件和“1.2.3”色谱条件进样分析，每次进样3 μL，测定峰面积，计算18种磺胺含量和RSD，结果发现，18种磺胺的RSD为2.7%～4.3%，表明该试验重复性良好。

2.6.5 加样回收试验。

精密称取9份已知18种磺胺的鹿鞭样品1.0 g，按照低、中、高剂量加入适量的18种磺胺标准品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，按“1.2.4”质谱条件和“1.2.3”色谱条件进样分析，每次进样3 μL，测定峰面积，计算18种磺胺含量和回收率及RSD。结果如表4，18种磺胺的平均加标回收率为81.2%～98.4%，RSD为1.2%～4.8%，表明该试验准确度较高。

2.7 实际样品检测

试验对60根鹿鞭样品按“1.2.2”进行前处理，按“1.2.4”质谱条件和“1.2.3”色谱条件进样分析。結果发现，1份检出磺胺甲恶唑，含量为0.14 μg/kg，其余的均未检出。

3 结论

该试验以乙腈为提取溶剂、超声涡旋提取，PSA、C18与中性氧化铝净化，建立以UPLC-MS/MS法检测梅花鹿鹿鞭中18种磺胺的检测方法。该方法具有操作简便、净化效果显著、灵敏度高、准确性好、检出限低等优点，可用于梅花鹿鹿鞭中18种磺胺的检测。该方法的建立为鹿鞭的质量评价研究提供了坚实的理论基础。

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