响应面分析法优化砂海星皂苷提取工艺研究

李敏晶 姚珊珊 刘远

摘要 [目的]采用响应面分析法优化砂海星皂苷的提取工艺。[方法]在单因素试验条件下探讨乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间4个因素对砂海星皂苷提取率的影响，并得到各因素的最佳试验条件，然后使用Design Expert 8.056软件建立二次响应面回归模型，利用响应面法分析砂海星皂苷提取的最佳提取工艺条件。[结果]砂海星皂苷的最佳提取工艺条件为乙醇浓度79%、提取时间2.8 h、提取温度89 ℃、料液比为1∶27（g∶mL），在此试验条件下，砂海星皂苷的提取率为8.04%。[结论]该研究为砂海星资源的进一步开发提供理论依据。

关键词 响应面法;砂海星;皂苷;提取工艺

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the extraction process of saponins from Luidia quinaria by response surface analysis.[Method] Single factor experiments were conducted to investigate the effects of ethanol concentration， solidliquid ratio， extraction temperature and extraction time on the extraction ratio of saponins from Luidia quinaria， and the optimum experiment conditions of each factor were obtained. Then， a quadratic response surface regression model was established by using Design Expert 8.056 software. Response surface method was used to analyze the optimal extraction conditions of saponins.[Result]The optimal extraction conditions of saponins were as follows： ethanol concentration was 79%， extraction time was 2.8 h， extraction temperature was 89 ℃， and solidliquid ratio was 1∶27. Under this condition， the extraction ratio of saponin was 8.04%.[Conclusion] This research provides theoretical basis for the further development of Luidia quinaria resources.

Key words Response surface method;Luidia quinaria von martens;Saponin;Extraction process

砂海星属于棘皮动物门（Echinodermata）海星纲（Asteroidea）瓣棘总目（Valvatacea）显带目（Paxillosida）砂海星科（Luidiidae Verrill），广泛分布于黄渤海、东海、南海及台湾海域[1]。动物界所含皂苷只存在于海洋的棘皮动物门，而海星的所有组织中都含有皂苷，且海星皂苷具有重要的生理活性和多样的药理活性。海星中的皂苷根据它们的化学结构主要可以分为硫酸酯甾体皂苷、环状甾体皂苷和多羟基甾体皂苷3种类型[2]。海星皂苷最早的报道出现于20世纪60年代，是由日本学者Hashimoto发表的。Hashimoto等[3]研究发现海星皂苷的苷元与海参皂苷元骨架不同，因此为其命名为海星皂苷（asterosaponins）。国外关于海星皂苷的结构、活性、药理等方面的研究报道较多。Dubois等[4-5]从海星Asterina pectinifera中发现并鉴定了6种皂苷化合物，且这些皂苷对L120和KB肿瘤细胞具有抑制活性;Iorizzi等[6]从海星Echinasteridae中分离得到7种海星皂苷、13种多羟基甾体皂苷，并测定了这些皂苷化合物对非小细胞肺癌细胞的抑制活性;Findlay等[7]从海星Asterias forbesi中分离得到了海星皂苷Forbeside A-H，并验证其降血压作用;De等[8]从南极海盘车科海星中分离得到5种海星皂苷其对非小细胞肺癌细胞具有较强的抑制活性;到目前为止，已从海星纲3个主要目（瓣海星目、桩海星目、钳棘目）14个科的60多种具代表性的海星中分离获得近400多种甾体化合物，对于海星皂苷的研究正在逐步深入。通过大量的文献证明海星的药用资源丰富，我国大部分海域都有分布，其研究与开发的潜力巨大。笔者采用响应面分析法对砂海星皂苷的提取工艺进行优化，以期为砂海星资源的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料與试剂

砂海星，采自黄海海域，经鉴定为砂海星（Luidia quinariavon Martens.）;皂苷标准样品由大连海洋大学实验室提供;无水乙醇、浓硫酸、香草醛等试验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SP-752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;BSA224S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;THZ-82电热恒温水浴锅，常州金坛精达仪器制造有限公司;101G-1B电热鼓风干燥箱，上海实验仪器总厂;SY2-4离心机，北京医用离心机厂;SHB-Ⅲ循环水真空泵，郑州长城科工贸有限公司;RHP-600型高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制。

取0.5 mL梯度浓度海星皂苷标准品溶液，加入0.5 mL 8%的香草醛，在冰浴中加入5 mL 72%的浓硫酸，充分摇匀，放入62 ℃的恒温水浴中，保温20 min。取出后置于冰浴中冷却，再摇匀，在544 nm处测量吸光度，绘制标准曲线。

1.3.2 皂苷的提取。

将砂海星干燥粉碎，过20目筛，得到砂海星粗粉。精确称取1.0 g砂海星粗粉，置于60 mL回流装置中，设置相应的参数条件以考察不同工艺下皂苷的提取率。将提取液在4 000 r/min离心10 min，取上清液按“1.3.1”的方法测定提取液中的皂苷含量。

1.3.3 单因素试验。

对乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间4个影响皂苷提取效果的参数进行单因素试验，分别考察乙醇浓度60%、70%、80%、90%、100%;料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL）;提取温度30、40、50、60、70、80、90、100 ℃;提取时间1、2、3、4、5、6 h等不同提取条件对皂苷提取率的影响。

1.3.4 响应面优化试验。

在单因素试验的基础上设计4因素3水平Box-Benhnken模型试验[9-10]，把砂海星皂苷的提取率作为响应值（Y），把“1.3.3”中的4个因素作为自变量，按照表1设计试验因素及水平分别进行试验。使用Design Expert 8.056软件进行响应面的设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对砂海星皂苷提取率的影响。

由图1可知，乙醇浓度在60%～80%时，砂海星皂苷提取率随乙醇浓度的增加而增加，在乙醇浓度为80%时达到最大，此时提取率为2.02%;乙醇浓度大于80%时，砂海星皂苷提取率逐渐下降，可能与皂苷的结构和极性相关。因此，选择最佳乙醇浓度为80%。

2.1.2 料液比对砂海星皂苷提取率的影响。

由图2可知，砂海星皂苷提取率随料液比增加呈先缓慢增加后显著增加的趋势，达到最高后又开始下降，当料液比在1∶10～1∶25，皂苷的提取率与料液比呈正相关，最大提取率出现在1∶25时，说明此时固体与液体接触面积在当前试验条件下已达到最大，为2.14%。当料液比在1∶25～1∶35皂苷含量不断下降，此时可能有更多杂质溶出。因此，选择最佳料液比为1∶25。

2.1.3 提取温度对砂海星皂苷提取率的影响。

由图3可知，提取温度在30～50 ℃时，砂海星皂苷提取率增加并不显著;50～ 80 ℃时，随温度增加，砂海星皂苷提取率增加速度较快，当达到80 ℃时分子热运动相对剧烈，增加了皂苷分子的溶出，此时提取率达到最大，为4.56%，随后，温度再增加，砂海星皂苷提取率逐渐下降。分析其原因是在温度较高的条件下，皂苷结构被破坏。因此，选择最佳提取温度为80 ℃。

2.1.4 提取时间对砂海星皂苷提取率的影响。

由图4可知，提取时间在1～3 h时，砂海星皂苷提取率随提取时间增大而增大，在提取时间为3 h时，提取率达到最大，继续增加提取时间，砂海星皂苷的提取率反而会降低。分析原因是提取时间过长会使其皂苷成分不再继续被溶出反而发生副反应使分子结构遭到破坏，同时随着提取时间的增加，杂质溶出量也会增多。因此，选择最佳提取时间为3 h。

2.2 响应面试验

2.2.1 试验设计方案及结果。

以单因素试验结果确定了乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间4个影响因素的设计水平，以Design-Expert 8.056 软件进行Box-Benhnken响应面试验设计，试验结果如表2所示。

2.2.2 回归模型分析。

根据表2的试验设计进行回归拟合，建立皂苷提取率（Y）与乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、料液比（D）之间的回归模型，拟合后以编码因子表示的方程为：

2.2.3 响应面中各因素对砂海星皂苷提取率的影响。

利用Design-Expert 8.056 软件做不同因素间响应面分析图与等高线图，结果如图 5 所示。

3 结论

采用单因素控制变量法，研究了乙醇浓度、提取时间、提取温度和料液比对砂海星皂苷提取率的影响，单因素试验结果显示，乙醇的最佳浓度为80%，提取时间3 h最好，提取温度80 ℃效果最好，料液比1∶25最佳;并根据单因素试验结果确定了各因素的水平设置。利用响应面分析法优化了砂海星皂苷的提取工艺，结果表明，这些影响因素中提取温度和料液比最显著，其次是提取时间，乙醇浓度的影响最不显著。同时在进行砂海星皂苷提取时，还要考虑温度和料液比之间的相互影响。由响应面法得出最佳提取工艺条件为乙醇浓度79%、提取时间2.8 h、提取温度89 ℃、料液比1∶27，此时的砂海星皂苷提取率为8.04%，此法适用于优化砂海星皂苷的提取工艺。今后可进一步将皂苷进行柱层析分离纯化及活性测定，为砂海星资源的进一步开发提供一定的理論依据。

参考文献

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