油用牡丹黑斑病病原菌的分离鉴定

常雪 任爱芝 张汕

摘要 [目的]明确油用牡丹常见的黑斑病病原菌。[方法]通过组织分离法对油用牡丹黑斑病病原菌进行分离、纯化，按照柯赫氏法则进行致病性鉴定，并利用形态观察结合分子生物学手段对病原菌进行鉴定。[结果]油用牡丹黑斑病的病原菌为链格孢（Alternaria alternata）。[结论]该研究结果为油用牡丹病害综合防控奠定了基础。

关键词 油用牡丹;黑斑病;病原菌;形态学鉴定;分子鉴定

Abstract [Objective] To identify the pathogen of oilseed peony black spot.[Method]The pathogen of oilseed peony black spot was isolated and purified by tissue isolation method.The pathogenicity was proved by the Kochs rule.The pathogen was identified based on morphological characteristics and molecular systematic.[Result]The pathogen of oilseed peony black spot was identified as Alternaria alternata.[Conclusion] The results of this study provided a foundation for the comprehensive prevention and control of oilseed peony diseases.

Key words Oilseed peony;Black spot; Pathogen;Morphological identification;Molecular identification

油用牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）属于芍药科（Paeonia ceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect.Moutan DC），是结实能力强、出油率高的一类牡丹的统称[1]。牡丹籽油不饱和脂肪酸含量高达92%，特别是α-亚麻酸含量高达42%以上[2]。α-亚麻酸是一种人体所必需的不饱和脂肪酸，具有保护心血管及神经元，抗氧化，治疗骨质疏松、炎症和癌症的功效[3]，但在人体内不能自身合成，必须从食物中获取[4]。除具有α-亚麻酸所具有的功能外，牡丹籽油还具有杀菌、抗肿瘤、治疗心血管疾病[5-6]、降低胆固醇、护肝[7-10]等保健功能，而且比花生等常见食用油抗氧化性强，更耐储存[11-12]。可见牡丹籽油是一种品质非常优良的高端食用油。另外，牡丹籽油可以添加于日用防护品中起到美白防晒的功效[13-14]。2011年牡丹籽油获得新资源食品批准[15]，牡丹籽油正式进入商业化生产和销售，油用牡丹成为国家木本油料战略发展的重要品种，油料牡丹种植产业得到了快速发展。

随着油用牡丹种植面积的逐年扩大，其病害的发生情况日益严重，极大地阻碍了该产业的健康、有序和快速发展[16]。黑斑病是油用牡丹常见的一种真菌病害，一般在8—9月高温、多湿时发病，主要侵染叶片，产生灰黑色圆形病斑。为了保护油用牡丹种植业可持续发展和保证牡丹籽油的无污染及高品质，笔者对油用牡丹黑斑病病害开展了研究，分离纯化得到其病原菌，利用形态学和分子生物学的手段对病原菌进行鉴定，旨在为油用牡丹黑斑病的综合防控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年5—10月在聊城市东阿、冠县、东昌府区田庄苗圃等油用牡丹种植地块采集新鲜病叶，记录发病情况并拍照，并于冰箱4 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化。采用组织分离法对油用牡丹黑斑病病原菌进行分离[17]。用自来水冲洗干净病叶后，在病健交界处剪取3～5 mm的小块。把剪取的病叶在超净工作台中用75%乙醇冲洗10 s，再用次氯酸钠溶液冲洗30 s，最后用无菌水冲洗3次，待水分挥发干后放置于含有1‰乳酸的PDA平板上，每皿3块，置于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养。待长出菌落后进一步纯化得到纯菌种。把纯化的病原菌接种于PDA斜面培养基上，待菌落长满培养基后，于冰箱4 ℃冷藏备用。

1.2.2 病原菌的致病性测定。将培养7 d的病原菌用打孔器打成直径5 mm的菌饼，选取长势一致的油用牡丹健株，将菌饼的菌丝面贴置于健康叶片上，用塑料袋罩住整棵植株后，在25 ℃条件下恒温保湿培养。每天记录观察。待接种后的叶片发病后，观察其症状，并按照柯赫氏法则，重新分离纯化，检测分离的病原菌是否和接种的病原菌相一致。

1.2.3 病原菌形态学鉴定。将分离纯化的病原菌接种到PDA培养基上，观察菌落生长速度、形态、产生的色素等。挑取病原菌制片，显微镜观察其菌丝、分生孢子梗和分生孢子等形态特征，拍照记录。

1.2.4 病原菌分子鉴定。采用CTAB法[18]提取病原菌基因组DNA，利用真菌18S rDNA序列通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和NS4（5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′）进行PCR扩增，PCR反应程序：预变性95 ℃ 3 min;变性95 ℃ 30 s，退火47 ℃1 min，延伸72 ℃ 1 min，32個循环;继续延伸72 ℃10 min。回收测序，NCBI数据库对序列进行BLAST，并采用DNAman对下载的18S rDNA序列进行同源比对和构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 油用牡丹病害的症状

通过对鲁西北油用牡丹病害开展调查，发现黑斑病发生普遍且严重，病害主要危害叶片（图1）。初期叶面或叶柄上会形成近圆形病斑，中央灰白色，边缘灰黑色，田间遇雨湿度大时病部会形成黑色霉层，并产生同心状轮纹。该病病斑扩展较慢，一般8—9月发病重。病情严重时可造成叶片穿孔、脱落，以致整株死亡。

2.2 病原菌致病性鉴定

将纯化的病原菌用5 mm打孔器制备菌饼，接种到健康油用牡丹植株叶片（图2A），3 d后叶片菌饼接触部位开始出现病斑，5 d后可明显看到圆形黑色病斑，形成黑色霉层，正面为黑褐色，背面为浅褐色（图2B、C），14 d后叶片产生明显的同心状轮纹，并出现穿孔（图2D）。对发病后的叶片重新组织分离，得到与接种菌培养性状相同的病原菌（图2E）。

2.3 病原菌形态特征

病原菌于PDA培养基上最初菌落正面为白色，随着培养时间的延长，逐渐变为墨绿色，最后变为暗褐色至黑色，菌落背面呈墨绿色至黑色。菌丝有隔，分生孢子梗暗褐色，单生或数根丛生，有分支，直立或弯曲，顶生分生孢子，分生孢子单生或链状着生，卵形，长椭圆形或倒棍棒形，淡褐色，1～4个纵、斜隔膜和3～8个横隔膜，分隔处略缢缩或不缢缩（图3）。

2.4 病原菌的分子系统学鉴定

在对病原菌通过形态特征鉴定的基础上进一步开展分子系统学鉴定，以提取的菌株DNA为模板扩增18S rDNA序列，得到大小约为1 000 bp的预期条带（图4）。

将电泳条带回收测序，经BLAST分析显示，油用牡丹黑斑病的病原菌与链格孢属Alternaria sp.相似性为99%，结合形态特征确定油用牡丹黑斑病的病原菌为链格孢（Alternaria alternata）（图5）。

3 结论与讨论

油用牡丹种植产业刚起步，目前关于油用牡丹病害的研究较少，目前研究多集中于对病害症状的描述，对病原菌种类的鉴定也多限于形态学特征的观察[19-20]，但对于其病原、发生规律以及防治的研究尚不深入[21]。黑斑病是观赏牡丹上普遍发生的重要病害，有关观赏牡丹黑斑病病原菌长期只鉴定到属，陈松[20]报道牡丹黑斑病病原菌为一种链格孢，但没有明确其具体归于哪一个种。直到2015年石良红等[22]采用形态学结合分子系统学手段将泰安地区观赏牡丹黑斑病病原鉴定为链格孢（A.alternata）;2017年宣俊好等[23]将洛阳牡丹黑斑病的病原鉴定为链格孢。该研究通过形态学结合分子系统学将油用牡丹黑斑病的病原菌确定为链格孢（Alternaria alternata）。该研究结果与观赏牡丹黑斑病的鉴定结果吻合，表明该病原菌是牡丹上共同的病原类型。

鉴于链格孢属内有许多相似种，其形态学特征类似，特别是一些分类学家提出该属的分类仅根据ITS序列和18S rDNA序列还不能确定其种的归属，要根据多基因序列比对结果才能确认，其更进一步的鉴定有待继续开展，但目前所取得的鉴定结果对于该病害综合防控具有重要指导意义。

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