超声提取-单颗粒电感耦合等离子质谱法测定牙膏中纳米银颗粒

史瑞新 赵艳萍 管鹏 梁维新 荀合

摘 要 建立了超声提取-单颗粒电感耦合等离子体质谱法（Single particle-inductively coupled plasma-mass spectrometry，SP-ICP-MS）同时测定牙膏中纳米银颗粒（AgNPs）的粒径分布、数量浓度和质量浓度的方法。以0.1% Tx-100超声提取牙膏中的AgNPs，在SP-ICP-MS模式下测定牙膏中AgNPs的粒径分布、数量浓度和质量浓度，考察了方法的最佳提取时间、准确性和检出限。实验结果表明：最佳提取时间为10 min，采用SP-ICP-MS法测定不同粒径的AgNPs标准品，测定结果与标准值一致;方法的粒径检出限、数量浓度检出限和质量浓度检出限分别为23 nm、3.9×108 particles/kg和26 ng/kg;在牙膏樣品的加标回收实验中，纳米颗粒回收率在86.6%～93.8%之间。 本方法简单、快速，为牙膏中AgNPs的测定提供了准确的方法。

关键词 纳米银颗粒;单颗粒电感耦合等离子体质谱法;牙膏

1 引 言

随着纳米技术的快速发展，大量纳米颗粒产品被广泛应用于各领域的商品中，其中，纳米银颗粒（AgNPs）因其对多种微生物具有良好的杀灭和抑制作用，在日用品、化妆品以及生物医药等与人类生活密切相关的领域大量使用[1]。相关研究指出，纳米材料长期暴露于人体，将会穿透皮肤粘膜，经血液循环到达各脏器，产生不利的生物效应[2]，其作用大小与纳米材料的粒径、数量和浓度密切相关[3]，日用品是人体内AgNPs的主要来源[4]。

目前，纳米颗粒的测定和表征手段主要有扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）、动态光散射（DLS）以及纳米颗粒跟踪分析（NTA）等，但该类技术存在分析成本高、样品制备步骤复杂、尺寸以及检出限较差等不足[5]。采用流场分离[6]、流体动力色谱[7]等分离技术，并与电感耦合等离子体质谱联用，可用于分离和表征纳米颗粒，但此类联用技术检出限较高，需要复杂的样品富集步骤[8]。单颗粒电感耦合等离子体质谱法（Single particle-inductively coupled plasma-mass spectrometry，SP-ICP-MS）由Degueldre等[9]在2003年提出，该方法简便、灵敏度高、检出限低，分析时间短[10]，可同时实现纳米颗粒的数量浓度测定以及粒径分布表征。近年来，SP-ICP-MS法已被应用于环境样品[11～14]、食品[15]、日化用品[16]、纺织品[17]、生物样品[18～20]中纳米颗粒的表征和测定。由于纳米颗粒普遍存在于复杂基质样品中，必需的样品前处理过程容易造成纳米颗粒物的团聚或分解，影响测定的准确性。因此，复杂基质样品中纳米颗粒的分析表征方法是目前SP-ICP-MS研究的一个主要难点及方向。牙膏是与人体消化道长期直接接触的物质，抗菌牙膏中含有的AgNPs可直接进入人体，并会在体内蓄积，对人体产生内暴露危害影响。目前，尚未见牙膏中的纳米颗粒物分析表征方法的报道。为此，建立稳定可靠的纳米银颗粒表征方法对于日用品安全性毒理学评价具有应用价值。

本研究将超声提取与SP-ICP-MS进行联用，考察了超声条件对AgNPs的提取和测定影响，建立了超声提取-单颗粒电感耦合等离子体质谱法同时测定牙膏中AgNPs的粒径分布、数量浓度和质量浓度。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Agilent ICP-MS/MS 8800三重四极杆电感耦合等离子体串联质谱仪（美国安捷伦公司）;BSA224S-CW型电子分析天平（德国赛多利斯公司）;BILON-250Y超声波处理器（上海比朗仪器有限公司）。

HNO3（电子级，德国Merck公司）;Ag标准储备溶液（1000 mg/L，国家钢铁研究院）;40、60和80 nm AgNPs标准储备液（20 mg/L，美国Sigma公司）;含有1 μg/L的Ce、Co、Li、Tl、Y的调谐液（美国安捷伦公司）;曲拉通（聚乙二醇辛基苯基醚，江苏强盛功能化学股份有限公司，分析纯，浓度为0.1%）。 实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ· cm）。

选用3种市售抗菌牙膏作为研究对象。

2.2 SP-ICP-MS仪器操作条件

采用调谐液对ICP-MS仪器进行调谐，使ICP-MS灵敏度达到最佳状态。采用ICP-MS的“No Gas”调谐模式对107Ag进行测定，相关仪器操作条件见表1。

2.3 标准溶液的配制

标准离子响应溶液的配制：采用0.5% HNO3将Ag+标准储备溶液稀释至0.2、0.5、1、5和10 μg/L的标准工作溶液，用于测定ICP-MS对Ag+的响应灵敏度;标准参比颗粒物溶液的配制： 以水将60 nm AgNPs标准储备液稀释为100 ng/L 标准工作溶液，用于计算传输效率。

2.4 样品处理方法

2.4.1 超声提取-SP-ICP-MS 使用曲拉通溶液提取牙膏中的AgNPs[21～23]。 挤出20 mm膏体，弃去，准确称取0.1 g 牙膏样品，置于50 mL离心管中，使用0.1% Tx-100溶液定容至30 mL后，振荡摇匀，超声10 min，以水稀释至一定倍数后，摇匀，备用。空白样品按照相同步骤处理，但不添加牙膏样品。

2.4.2 元素总量测定 弃去样品头部20 mm 膏体后，准确称取牙膏样品0.25 g 于50 mL烧杯中，加入6 mL王水（浓HCl-浓HNO3，1∶3，V/V），加热至样品溶解后，滴加5滴H2O2，加热消化至近干后，以1% HNO3定容至50 mL，摇匀备用[24]。空白样品按照相同步骤处理，但在过程中不添加牙膏样品。

3 结果与讨论

3.1 方法原理

SP-ICP-MS是在传统ICP-MS的基础上，采用“单颗粒分析”工作模式的分析技术。当单个纳米颗粒被引入到质谱仪后，受到等离子体的激发，形成一簇离子云，到达检测器后，在短暂的驻留时间内形成较强的脉冲信号，通过记录每个驻留时间内的强度值形成时间分辨数据。在时间分辨数据中，脉冲信号的数量与溶液中纳米颗粒的数量成正比关系，脉冲信号的强度与纳米颗粒的质量以及粒径相关，因此，通过SP-ICP-MS可以同时提供纳米颗粒的粒径分布以及质量浓度等信息。

Peters等[26]提供了一种纳米颗粒物浓度以及粒径的分布和计算方法。通过已知颗粒浓度的标准溶液在单位时间内检測到的脉冲信号数量以及样品流速计算传输效率，采用传输效率、标准离子响应强度以及脉冲信号强度计算纳米颗粒的质量及其粒径，计算公式如下：

其中，Cp为颗粒数量浓度（particles/L）;NP为在时间范围内检测到的颗粒数（particles/L）;ηn为传输效率;V为样品流速（mL/min）;Ip为样品中纳米粒子的信号强度（cps）;mp为纳米颗粒质量（ng）;RFION为离子响应强度（cps/μg/L）;td为停留时间（s）;Mp为纳米粒子的摩尔质量;Ma为纳米粒子中待测元素的摩尔质量;dp为纳米粒子的粒径（nm）;ρp为纳米粒子的密度（g/mL）;Cm为纳米粒子质量浓度（ng/L）。

3.2 干扰元素考察

测定107Ag的主要干扰为多原子化合物91Zr16O、67Zn40Ar等。本研究将牙膏样品消解后，采用ICP-MS氦气碰撞反应模式测定了3种牙膏样品中各元素含量（表2）。 实验结果表明，3种牙膏样品的消解液均为澄清溶液，Zn、Zr的含量分别为2.29～3.51 μg/g 和0.22～2.66 μg/g，样品中的Zn和Zr浓度较低，在SP-ICP-MS分析模式中，其形成的多原子化合物干扰信号将会处于背景信号区域中[8]（见图1A），因此，无需气体碰撞池即可与AgNPs脉冲信号区分;同时，由于引入反应碰撞气体，将会降低仪器107Ag的灵敏度，因此，后续实验中AgNPs的测定采用“No Gas”调谐模式。

3.3 提取条件考察

考察了超声时间对3种牙膏中AgNPs提取效果的影响。分别向3种牙膏中加入适量的60 nm AgNPs，混合均匀，并稳定5 h后，使用0.1% Tx-100溶液定容至30 mL，分别超声5、10和15 min，以水稀释一定倍数后，采用SP-ICP-MS法测定。计算稀释液中AgNPs的数量浓度及其加标回收率，结果见表3。当提取时间为10 min时，3种牙膏的颗粒回收率在85.4%～92.7%之间;3种牙膏的加标回收率均低于100%，这是由于牙膏的基质影响，使AgNPs在基质中持续释放Ag+，导致部分的颗粒被分解[23]。

3.4 SP-ICP-MS响应因子以及传输效率的计算

标准响应因子用于将每个脉冲信号转换为对应的纳米颗粒质量，以cps/（μg/L）单位表示，其数值的大小即为离子标准质量浓度曲线的斜率[17]，通过计算，本研究中107Ag的响应因子为40440 cps/（μg/L）。 传输效率为纳米颗粒进入等离子体与雾化器中的数量比率，本研究采用已知浓度的AgNPs标准工作液测定ICP-MS的传输效率，测定前，使用3% HNO3和水分别冲洗ICP-MS进样系统10 min，在优化后的实验条件下，根据公式（1）计算得该仪器的传输效率为3.2%。

3.5 SP-ICP-MS方法准确性

在进行样品测定前，在空白牙膏稀释液（稀释103倍，含有0.0001% Tx-100）中加入40、60和80 nm浓度为100 ng/L的AgNPs标准品进行测定，验证SP-ICP-MS的准确性，结果见表4和图1。由图1可知，3种AgNPs的脉冲信号均可以较好地与背景信号分离，脉冲信号的强度值与纳米颗粒标准品的粒径呈正相关，脉冲整体呈正态分布。对比标准值与本方法对AgNPs的测定值（表4）可知，通过SP-ICP-MS获得的AgNPs颗粒浓度和粒径均与标准值一致。

3.6 方法检出限

本研究采用迭代算法计算纳米颗粒的粒径检出限（LODs）。 首先根据公式（5）计算区别于背景信号区分的最低脉冲信号强度In+1，然后将其代入至公式（2）和（3）中，计算得到本方法对AgNPs的粒径检出限为23 nm;在SP-ICP-MS模式下，测定空白对照样品，平行实验7次，计算脉冲信号数量的平均值及其标准偏差，由于牙膏样品需稀释进样，以1000倍稀释倍数计算，本方法对AgNPs的数量浓度检出限（LODNP）为3.9×108 particles/kg。质量浓度检出限（LODMP）通过计算数量浓度检出限以及粒径检出限对应的纳米颗粒质量得出，以23 nm AgNPs和1000倍稀释倍数计算，本方法的质量浓度检出限为26 ng/kg。

其中： In+1为在与背景信号区分的最低信号强度（cps）;In为第n次迭代运算中所有信号强度的平均值（cps）;ISD为第n次迭代运算中所有信号强度的标准偏差;LODs粒径检出限（nm）;dp为根据式（3）计算所得粒径（nm）;LODNP为数量浓度检出限（particles/kg）;Np为空白对照样品中所测得的纳米颗粒脉冲信号的平均数量;SDP是空白对照样品中纳米颗粒脉冲信号数量的标准偏差;ηn为传输效率;V为样品流速（mL/min）;ta为测定时间（min）;LODMP为质量浓度检出限（ng/kg）;mp为粒径检出限对应的纳米颗粒质量（ng）。

3.7 牙膏样品中纳米银SP-ICP-MS表征

采用所建立的SP-ICP-MS方法對3种牙膏进行测定，由于颗粒浓度过高的溶液将会导致两个或多个纳米颗粒同时进入等离子体质谱仪中，并受到激发，造成在同一驻留时间内发生脉冲信号的叠加[27]，在单纳米颗粒测定中，待测溶液中颗粒浓度范围应维持在106～109 particles/L之间[28]，本研究中牙膏样品的颗粒浓度均被稀释至此范围后再进行测定。测定结果如图2和表5所示，牙膏3出现了明显的AgNPs脉冲信号，

经计算得到此样品中AgNPs的平均粒径为39 nm，质量浓度为22.86 μg/g，与表2计算的总银含量（31.45 μg/g）接近，牙膏1以及牙膏2中均未检出AgNPs。加标实验结果表明，加标后牙膏3的原始信号强度明显增强，粒径分布图中出现了60 nm AgNPs的峰，3组加标样品计算的平均粒径均与标准值一致，纳米颗粒回收率在86.6%～93.8%之间。

4 结 论

建立了超声提取-SP-ICP-MS法同时测定牙膏中AgNPs粒径分布、数量浓度以及质量浓度的方法。首先确定方法的离子响应强度以及传输效率，采用0.1% Tx-100提取牙膏中的AgNPs，稀释一定倍数后，采用SP-ICP-MS法测定。本方法分析速度快，灵敏度高，可快速测定牙膏中的AgNPs粒径分布、数量浓度和质量浓度。

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