阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠神经元凋亡的抑制作用

唐菁华 孙秀勤 王建军

颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是一种常见的外伤，主要表现为意识障碍、头痛、呕吐等。研究显示，TBI 后缺血缺氧、神经细胞凋亡、炎性反应等可引起一系列继发损伤，导致脑缺血、脑梗死甚至死亡[1]。阿托伐他汀具有调脂、抗氧化、抗炎等药理学作用，可以通过血脑屏障，临床常用于心脑血管疾病的治疗[2]。有研究显示，阿托伐他汀可以改善TBI大鼠的神经功能，保护脑组织损伤[3]，但作用机制尚不清楚。本研究探讨阿托伐他汀对TBI大鼠神经元凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF级SD雄性大鼠30只，体重230～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2015-0001。按随机数字表法随机分为假手术组、模型组和阿托伐他汀组，各10只。模型组和阿托伐他汀组参照液压打击法制作TBI模型，假手术组仅打开骨窗，不进行打击损伤。

1.2 动物造模及给药 模型组和阿托伐他汀组大鼠参照液压打击法制作TBI模型[4]。腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液（2 ml/kg）麻醉，常规消毒皮肤，于大鼠头部正中切开头皮约3 cm，剥离颅骨膜，用磨钻钻取直径约4 mm骨窗。调节管口对准骨窗，采用液压脑创伤仪（MODEL01-B，美国 NEW SUN 公司）建立大鼠液压脑创伤模型，设置强度为101.3～152.0 kPa。大鼠出现呼吸暂停数秒、四肢抽搐或小便失禁等，则为造模成功。造模成功后，阿托伐他汀组大鼠立即灌胃阿托伐他汀（1 mg/kg；辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408），每天1次；模型组和假手术组灌胃等量生理盐水；连续灌胃2周。

1.3 大鼠神经功能评估 给药结束后第2 天，参照Zea Longa 5分制标准[5]进行神经功能评分。

1.4 取材 神经功能评估结束后，立即处死大鼠，迅速断头取脑，取大鼠脑皮质损伤组织，将其分为2份，一份置于4%多聚甲醛中固定，进行常规的脱水、透明、包埋和切片，用于HE和末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色；另一份置于-80 ℃保存，用于免疫印迹法检测。

1.5 脑组织病灶的病理变化和神经元凋亡的观察 一份切片进行HE 染色，光镜下观察组织的病理变化，每张切片随机取5 个视野拍照；另一份用于TUNEL染色，严格按照试剂盒说明操作染色，在光镜下观察，每张切片随机取5 个视野拍照。计算每个视野下细胞总数及阳性细胞数，并计算出比值，则视为细胞凋亡率。

1.6 血清炎症因子水平检测 采集大鼠股动脉血，3 500转/min离心10 min，取上清，采用酶联免疫吸附法测定血清白介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和IL-1β水平。严格按试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）说明书进行测定。

1.7 免疫印迹法检测神经元凋亡相关蛋白表达 免疫印迹法检测损伤脑组织Toll样受体4（Toll-like receptor，TLR4）、核转录因子（nuclear factor，NF）-κB p65、p-IκB、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleaved cysteine aspartic protease，cleaved caspase）-3 表达水平。取损伤脑皮层组织约50 mg，匀浆，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液溶解，使用细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA 法进行蛋白质定量，取50 μg总蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜至硝酸纤维素膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，采用TBST 洗膜后加入一抗（美国Santa Cruz 公司）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加二抗（美国DAKO公司）37 ℃孵育2 h，ECL 显影，采用凝胶成像系统分析蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析；以P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对TBI 大鼠脑组织损伤和神经功能的影响 HE 染色结果显示，假手术组大鼠脑组织细胞结构完整，未见明显病理变化；模型组大鼠脑组织疏松肿胀，神经元间隙明显增大，伴有炎性细胞浸润；阿托伐他汀组大鼠脑组织损伤程度较模型组明显改善，见图1。与假手术组[（0.24±0.05）分]相比，模型组[（2.67±0.31）分]和阿托伐他汀组[（1.52±0.23）分]神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组神经功能缺损评分明显下降（P＜0.05）。

2.2 阿托伐他汀对TBI大鼠神经元凋亡的影响 与假手术组[（14.38±3.62）%]相比，模型组[（48.62±8.58）%]和阿托伐他汀组[（32.76±7.94）%]神经元凋亡率明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组神经元细胞凋亡率明显下降（P＜0.05）。

2.3 阿托伐他汀对TBI 大鼠血清炎症因子水平的影响 与假手术组相比，模型组和阿托伐他汀组大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显下降（P＜0.05）。见表1。

2.4 阿托伐他汀对TBI 大鼠损伤脑组织TLR4、NFKB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3 表达的影响 与假手术组相比，模型组和阿托伐他汀组大鼠损伤脑组织TLR4、NF-KB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3的蛋白表达水平明显上调（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组大鼠损伤脑组织TLR4、NF-KB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3 蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）。见图3、表2。

3 讨论

阿托伐他汀是一种亲脂性的他汀类药物，可以通过血脑屏障，具有抗氧化、抗炎、清除自由基等药理作用，对于TBI 引起的小鼠脑组织损伤具有保护作用[6]。杨会杰等[7]研究显示，阿托伐他汀可以有效减轻局灶性脑缺血大鼠的脑组织损伤，促进神经功能的恢复。本文结果显示阿托伐他汀可显著改善TBI 大鼠脑组织损伤，促进神经功能恢复。研究表明，TBI引起的神经细胞凋亡和炎症反应是引起TBI后继发性脑组织损伤的主要原因[8]。IL-1β、IL-6 和TNF-α均为活化的单核巨噬细胞合成并分泌的一种致炎因子，可以诱导多种炎性介质的产生，参与脑组织损伤后的细胞水肿、炎症反应、细胞凋亡等病理过程，在TBI 后继发性脑组织损伤中具有重要作用[9]。Chu 等[10]研究表明，TNF-α可以调控凋亡相关蛋白Caspase-3 的表达，激活细胞凋亡级联反应，诱导细胞凋亡。本文结果显示阿托伐他汀明显降低TBI大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。这提示阿托伐他汀可能通过抑制机体炎症因子的释放，抑制神经元细胞凋亡。

图1 各组大鼠脑组织的病理变化（HE染色）

图2 阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠神经元凋亡的影响（TUNEL染色）

表1 阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠血清炎症因子水平的影响

表2 阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠损伤脑组织神经元凋亡相关蛋白表达的影响

图3 各组大鼠损伤脑组织TLR4、NF-κB p65、p-IκB、cleaved Caspase-3蛋白电泳图

史晓静等[11]研究显示，阿托伐他汀可以抑制NF-κB 炎症信号通路，抑制细胞凋亡。TLR4 属于Toll 受体家族，与多种疾病的发生、发展密切相关，可以通过调节NF-κB信号转导通路，调节机体的炎症反应[12]。当机体受到各种生理性或病理性刺激时，TLR4 可与相应的配体结合，发生二聚化，激活NF-кB信号通路[13]。在生理状况下，NF-кB与IκB结合处于被抑制转态，一旦被IκB 激活，发生磷酸化，可以释放NF-KB/p65，进入胞核与靶序列结合，促进IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子的表达[14]。王锦鹏等[15]研究发现，阿托伐他汀可以下调TLR4 表达，抑制MyD88 依赖的NF-κB 信号通路，抑制炎症因子TNF-α的释放。本文结果显示阿托伐他汀明显下调TBI 大鼠损伤脑组织TLR4、NF-κB p65、p-IκB和cleaved Caspase-3的表达。这提示阿托伐他汀可能通过调节TBI大鼠TLR4/NF-кB信号通路，抑制炎症因子的释放，抑制神经元细胞凋亡。

综上所述，阿托伐他汀可能通过抑制TBI 大鼠的TLR4/NF-кB 信号通路，抑制炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的释放，抑制神经元凋亡，保护脑组织损伤。