葛根素通过调控IL-6相关通路诱导宫颈癌细胞凋亡

成丽琴

(通山县中医院妇产科，湖北 通山 437600)

在全球范围内，宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，其发病仅次于乳腺癌，严重威胁女性的生命健康安全[1]。目前临床上治疗宫颈癌主要以手术结合化疗为主，但是长期以来宫颈癌患者病死率仍未见显著降低。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也给机体组织带来极大的损伤，其对黏膜、心脏、肝脏、肺、泌尿系统、神经系统、皮肤等均具有毒性反应，此外还可能引起过敏反应、静脉炎甚至抑制骨髓导致机体免疫力下降，造成严重并发症[2-3]。

经过长达几千年的筛选与实践，中药以其低毒、安全性和有效性被视为现代药物开发的宝库。葛根素是从葛根中提取出的异黄酮类化合物，具有抗炎、扩张血管、改善微循环的作用，临床常用于治疗心脑血管疾病。越来越多的研究表明葛根素具有显著的诱导肿瘤细胞凋亡的作用[4]，但对其诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其相关机制的研究不甚明了。本文拟探讨葛根素对Hela细胞行为学的作用及IL-6相关通路蛋白表达的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与细胞株

葛根素购自sigma公司,溶于DMSO后储存液浓度100mmol/L。宫颈癌Hela细胞系购自武汉大学典型培养物保藏中心。

1.1.2 实验试剂和仪器

DMSO购自上海翌圣生物科技有限公司，DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS磷酸盐缓冲液、青-链霉素双抗购自美国Thermo Fisher 生物公司。细胞凋亡试剂盒购自BD公司。IL-6 Elisa试剂盒、抗-STAT3、抗-Bcl2、抗-GAPDH抗体购自Proteintech公司。p-STAT3抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

宫颈癌Hela细胞株于5% CO2、37℃恒温恒湿细胞培养箱中培养，培养基为含10%胎牛血清、1%青-链霉素双抗的DMEM高糖培养液。每两天换液一次，细胞融合度达80%左右后，用含EDTA的胰蛋白酶消化液进行消化后传代。取处于对数生长期、生长状态良好且无污染的细胞用于实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力

将Hela细胞接种于96孔板，血清饥饿24h后分别加入含不同浓度葛根素(0、10、20、40μmol/L)的培养液中处理Hela细胞24、48、72h，每组各设3个平行对照孔。加入CCK-8试剂后于37℃环境中孵育1.5h，使用酶标仪于450nm波长处检测吸光值并计算细胞增殖活力。细胞活力(%)=实验组吸光值/对照组吸光值×100%。

1.2.3 细胞凋亡测定

浓度梯度葛根素作用于Hela细胞24、48、72h后，使用不含EDTA胰酶消化细胞，同时收集上清液中的细胞，离心后PBS清洗一遍后100μL 1×Annexin V结合液重悬，每组细胞分别加入5μL PE、5μL 7-AAD，室温下孵育15min后另加入400μL 1×Annexin V结合液，混匀后使用流式细胞仪检测细胞凋亡状态。通过Flow Jo软件对细胞凋亡率进行统计。

1.2.4 Elisa法测定IL-6含量

每孔取100μL细胞培养液上清液于96孔板，每组设3个平行对照孔，同时做标准品及培养液对照。按照说明书步骤进行操作，最后于酶标仪上读取96孔板每孔相应的OD值(450nm)。实验组OD值=每孔OD值-空白孔OD值；最后使用实验软件绘制标准曲线并求出相应位置样本中细胞因子含量。

1.2.5 Western blot检测Hela细胞信号通路相关蛋白表达

浓度梯度葛根素作用于细胞72h，加入RIPA裂解液裂解细胞并使用BCA法测定总蛋白浓度。取细胞裂解液50μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完毕后电转至PVDF膜上，2%BSA封闭液封闭1h，分别加入STAT3、p-STAT3、Bcl2、GAPDH一抗溶液4℃孵育过夜，第二日于37℃二抗溶液中孵育1h，滴加ECL曝光液并于成像系统中成像。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 葛根素对Hela细胞增殖能力的影响

和对照组(0μmol/L)比较，随着作用时间的增加，10、20、40μmol/L的葛根素均可明显降低细胞的增殖活性，且在72h时作用效果最为显著，因此选择72h为葛根素的作用时间，见图1。

与对照组(0μmol/L)比较，*P<0.05，n=3

2.2 葛根素对Hela细胞凋亡的影响

0、10、20、40μmol/L的葛根素处理细胞72h后，细胞凋亡率(%)分别为11.97±1.00、14.43±1.00、33.25±1.65、44.8±4.25。与对照组(0μmol/L)比较，10、20、40μmol/L葛根素处理均能够明显提高细胞凋亡状态，细胞凋亡水平同葛根素作用浓度呈正相关，见图2。

与对照组(0μmol/L)比较，*P<0.05，n=3

2.3 葛根素对Hela细胞外IL-6含量的影响

分别使用10、20、40μmol/L的葛根素处理Hela细胞72h后，使用Elisa法测定细胞外培养基中IL-6变化情况。结果显示，与对照组比较，葛根素可显著降低细胞培养基中IL-6含量，随着葛根素浓度增高，其降低IL-6效果越显著，见图3。

与对照组(0μmol/L)比较，*P<0.05，n=3

2.4 葛根素对Hela细胞中IL-6信号通路相关蛋白表达的影响

分别使用10、20、40μmol/L的葛根素处理Hela细胞72h后，通过Western blot检测相关指标表达。结果表明，与空白对照组比较，葛根素浓度≥10μmol/L时，宫颈癌Hela细胞中p-STAT3/STAT3以及Bcl2蛋白的表达水平以浓度梯度依赖的方式显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组(0μmol/L)比较，STAT3蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05),见图4。

图4 不同浓度葛根素对Hela细胞内IL-6信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

宫颈癌是发展中国家女性最常见的肿瘤之一，其发生仅次于乳腺癌[5]。葛根素又名异单酮，是从葛根中提取出来的单体成分，具有抗炎、抗衰老、保护神经细胞、改善微循环等多种作用，在心血管疾病的治疗中应用广泛[6]。近年来研究表明葛根素还具有抗肿瘤作用，对卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、宫颈癌[9]等恶性肿瘤具有显著的抑制作用，但其对宫颈癌细胞作用的具体机制研究较少。

大量研究已经证实炎症与肿瘤存在明显关系，其中促炎性细胞因子在肿瘤发生发展中起着强力的影响。IL-6已被证实在宫颈于宫颈上皮细胞促进其生长及放化疗抵抗[10]，其下游STAT3转录因子在大多数恶性肿瘤中高表达，磷酸化水平增高。二磷酸化后的p-STAT3可入核激活多种基因的启动子从而促进如增殖、凋亡、侵袭、转移等肿瘤恶性行为的发生。因此，IL-6/STAT3信号通路可作为抗肿瘤治疗与研究中的关键靶点。有研究表明，葛根素能有效降低糖尿病肾病患者血清中炎症因子癌进展中起促进作用，其可通过自分泌与旁分泌促进宫颈癌相关成纤维细胞衰老，或者作用IL-6表达水平，通过控制炎症改善患者24h尿量微蛋白水平[11]。因此，IL-6/STAT3通路可能是葛根素作用于恶性肿瘤的重要途径。

肿瘤治疗的关键是促进肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖。本实验通过CCK-8、流式细胞术、Elisa、Western blot等证明了葛根素对宫颈癌细胞Hela细胞具有明显抑制作用。不同浓度的葛根素对Hela细胞的增殖均具有明显的抑制作用，并且表现为明显的浓度与时间效应，40μmol/L的葛根素对Hela细胞的抑制作用最为显著。同时各浓度葛根素均可明显促进Hela细胞凋亡，40μmol/L葛根素对凋亡促进作用最明显，Western blot结果显示抗凋亡相关蛋白Bcl2的表达随葛根素浓度增高而减低，这些实验结果保持了一致性。此外，随着葛根素浓度的增高，细胞外IL-6表达水平显著降低，同时p-STAT3/STAT3蛋白比值逐渐降低，这表明葛根素可抑制细胞外IL-6的分泌以及STAT3的磷酸化，即可通过抑制IL-6/STAT3通路起到治疗肿瘤的作用。

综上所述，葛根素对宫颈癌Hela细胞具有显著抑制作用，具体表现为促进凋亡以及抑制增殖，抑制IL-6/STAT3通路可能是其关键作用机制。因此，作为一种低毒、安全有效的传统药物，葛根素在治疗宫颈癌方面具有极大潜力。