NaCl胁迫对‘Robina’百合叶片和根部抗氧化酶系统及根尖离子流速的影响

刘容秀，崔金腾,2,3，张克中,2,3*

(1. 北京农学院 园林学院，北京102206；2.城乡生态环境北京实验室，北京102206；3.北京乡村景观规划设计工程技术研究中心，北京102206)

土壤盐碱化严重影响到植物正常生长，对农业生产来说是一个主要的环境威胁[1]。盐胁迫是世界上许多地区公认的对农业和环境构成威胁最严重的非生物胁迫之一[2]。它可以破坏离子稳态导致离子毒害，紊乱渗透平衡使植物遭受严重缺水而引起干旱胁迫[3]，继而诱使植物根部缺氧导致氧化还原失衡，直接导致生物膜结构和功能完整性的丧失[4]。

植物受到盐胁迫后，一些响应盐胁迫的信号转导途径、转录因子和功能基因发生变化[5]；进而引起细胞水平及组织形成上发生变化[6]；最后抑制根系生长、改变根系结构、甚至导致根系死亡。研究发现，盐胁迫对膜质过氧化产物的二次损伤作用常通过测定膜质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量或电解质泄漏来检测[7]。同时植物可以大量积累渗透酶，维持渗透调节[8]；提高抗氧化酶活性来清除多余的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，避免氧化损伤[9]。而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)和过氧化氢酶(Catalase, CAT)是清除活性氧的重要抗氧化酶，其中SOD将超氧阴离子歧化为过氧化氢(H2O2)，POD和CAT则彻底将H2O2歧化分解[5]。此外，在盐胁迫下，植物对钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)等的吸收也会受影响，细胞内离子失衡，代谢紊乱，从而影响植物正常生长发育[10]。

百合(Liliumspp．)是多年生草本植物，是世界著名的球根花卉，具有很高的营养、药用和观赏价值，但是百合对土壤盐非常敏感，尤其是最受市场欢迎的东方杂种系百合[11-12]。目前，对百合的研究多集中在育种、高温胁迫及切花保鲜等方面，对百合耐盐性研究相对较少，也少见对百合耐盐性与离子流速变化关系方面的报道。本试验主要探究百合根部和叶片抗氧化酶系统对盐胁迫的响应，及盐胁迫下根尖Na+、K+、Ca2+的流速变化，以期为百合盐胁迫研究提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料为百合OT(Oriental×Trumpet)杂交系品种‘Robina’。在北京农学院东大地3号棚，选取大小一致、饱满、无病虫害、无机械损伤的种球，以草炭与珍珠岩体积比为2∶1为栽培基质，选用规格相同的种植框，每框随机种植10粒种球，每3 d浇1次水。30 d后，随机选择5框长势一致、健壮的百合为一组，用0(CK)、100、200、300、400 mmol/L的NaCl溶液处理，重复5组。处理24 h时，取完好无损百合根部3～5 cm，去离子水冲洗干净，用于测定根部离子流；处理的第3、6、9天，选取长势一致的植株，用去离子水快速洗净百合根部并擦干，快速称好后包上锡箔纸，迅速放入液氮罐中，保存于实验室内-80 ℃冰箱。

1.2 试验方法

1.2.1 生理指标测定 称取根0.3 g于预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末，然后转至5 mL离心管中，按质量(g)/体积(mL)=1/9的比例加入9倍体积的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH=7.2)，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗提酶液。

SOD活性测定采用氮蓝四唑法[13]；POD和CAT活性测定，以及MDA含量测定均采用南京建成科技有限公司试剂盒。

1.2.2 离子流测定 采用非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique, NMT)[14]实时动态测定百合根尖Na+流、K+流、Ca2+流。将取好的用于测离子流的根尖放入半径6 cm、容积为20 mL的塑料培养皿中，加入10 mL测试液浸没，平衡30 min，测试时更换新的测试液，并用提前在测试液中浸泡过的滤纸条和小石块固定样品，留出根尖处10 mm方便测试。每条根取3个不同的测试点，每个测试点持续稳定测试2 min，设5次重复。

Na+测试液：0.5 mmol/L NaCl；K+测试液：0.1 mmol/L KCl、0.1 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L CaCl2，pH 6.0；Ca2+测试液：0.5 mmol/L KCl、0.1 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L CaCl2，pH 6.0。

所有指标均重复测定5次，从中选取3组数据，使用WPS Office 2019 11.1.0.7989版本软件中的Excel进行实验数据录入、计算以及图表绘制。使用SPSS Statistics 20.0软件进行统计学分析。离子流速根据旭月科技有限公司的JCal V3.0软件(http://xuyue.net/mageflue)计算得出。试验中阳离子的流速为正表示离子外流，流速为负表示离子内流，且所得数据是净离子流速(即内外流相抵消后的流速)。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对百合抗氧化酶系统的影响

2.1.1 盐胁迫对百合SOD活性的影响 由图1可以看出，随着盐处理浓度的加大、处理时间的延长，百合根系SOD活性总体呈现先上升后下降的趋势；而叶片SOD活性随着盐处理浓度的加大，第3天呈现先上升后下降的趋势，第6天和第9天则是持续上升。根部在盐处理第3天和第6天，SOD活性均是在盐浓度为200 mmol/L时达到最高，且分别显著高于空白对照57.5%和75.3%，之后随着盐浓度升高SOD活性逐渐下降；第9天时SOD活性在300 mmol/L盐浓度下最高，比对照高出67.5%，差异显著。叶片在盐处理第3天，SOD活性在盐浓度200 mmol/L时最高，显著高于对照组22.6%；第6天和第9天时SOD活性均持续上升，400 mmol/L时分别比对照组显著高出20.5%和33.0%。

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)；图2同Note: Different small letters indicate significant difference between treatments(P<0.05);The same as below图1 不同浓度NaCl处理和胁迫时间对百合根和叶SOD、POD、CAT活性以及MDA含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations and treatment time of NaCl on the activities of SOD, POD, CAT and the content of MDA in lily roots and leaves

2.1.2 盐胁迫对百合POD活性的影响 百合POD活性总体来说随盐浓度的升高和处理时间的延长先上升后下降。根系在盐处理第3天和第9天时，POD活性都在300 mmol/L浓度时达到最高，且显著高于对照，分别高出63.4%和17.3%；在第6天时，POD活性随盐浓度升高持续上升，在400 mmol/L时显著高于对照86.8%，且处理第9天时POD活性明显被抑制。叶片的POD活性变化趋势与根系基本一致，不同的是在盐处理第3天和第9天时，叶片POD活性在200 mmol/L时达到最高，显著高于对照组43.3%和15.9%，第6天，400 mmol/L浓度下POD活性是对照的2.14倍。

2.1.3 盐胁迫对百合CAT活性的影响 根系CAT对盐胁迫较为敏感，盐处理第3天和第6天时，在100 mmol/L盐浓度处理下，活性就显著上升，随着盐浓度增加，在300 mmol/L时达到最高值，分别是CK的9.4倍和3.7倍，差异显著；第9天时各个盐浓度处理下的CAT活性都较第6天下降，各处理间随着盐处理浓度的加大持续上升，在400 mmol/L时比对照高出55.3%，差异显著。叶片CAT活性在盐处理第3天和第9天，随着盐浓度升高先上升后下降，且都在200 mmol/L时达到最大值，分别显著高于对照组18.5%和48.2%；第6天时，叶片CAT活性随着盐处理浓度增大持续升高，400 mmol/L浓度下是对照组的5.1倍，差异显著。

2.1.4 盐胁迫对百合MDA含量的影响 百合根系和叶片的MDA含量随着盐处理浓度的增加和处理时间的延长变化趋势基本一致，均持续上升(图1)。根系MDA含量在第3天，随着盐处理浓度的上升，持续升高，但趋势比较平缓，200、300和400 mmol/L浓度下分别比对照组高出62.2%、72%和81.4%，差异显著，但三者之间并无显著差异；第6天，MDA含量在300 mmol/L浓度下最高，是对照组的2.7倍，400 mmol/L时是对照组的2.6倍，但二者之间差异不明显；第9天时，随着盐浓度加大，MDA含量上升速度较快，400 mmol/L盐处理下，MDA含量是对照组的4倍。叶片MDA含量则在盐处理3、6、9 d时变化都不如根系剧烈，随着盐处理浓度的加大持续升高，400 mmol/L浓度下分别比对照组高出0.67倍、1.12倍、0.97倍，差异显著。

2.2 盐胁迫对百合根尖Na+、K+、Ca2+净流速的影响

2.2.1 盐胁迫对百合根尖Na+净流速的影响 由图2可知，百合根尖Na+流向在对照组和处理组中均表现为外流，且随着盐处理浓度的增加，流速呈现先升高后下降趋势，且在测定离子流的2 min内，对照及各个处理下根尖的Na+流速比较稳定。盐胁迫处理24 h后，根尖Na+外流速度在空白对照组中平均为238.68 pmol/(cm2·s)，随着盐处理浓度增加，在200 mmol/L处理下达到最高，最高达到991.99 pmol/(cm2·s)，平均流速约是对照组的4倍；盐浓度300 mmol/L时，根尖Na+外流速度下降，比200 mmol/L平均下降84.55 pmol/(cm2·s)，是对照组的3.6倍；在400 mmol/L盐处理下，根尖Na+外流速度下降幅度大，但仍显著高于对照组约82.8%。

2.2.2 盐胁迫对百合根尖K+净流速的影响 百合根尖K+在对照和处理组中同Na+流向一样，均表现为外流，且随着盐处理浓度的增加外流速度先上升后下降。不同浓度NaCl处理24 h后，对照组的根尖K+平均流速为52.8 pmol/(cm2·s)，流速低且无较大波动(图2)；在100 mmol/L浓度处理下根尖K+净流速上升为231.05 pmol/(cm2·s)，约是对照组的4.4倍；200 mmol/L时外排流速平均达到最大为507.9 pmol/(cm2·s)，最高时可达538.6 pmol/(cm2·s)，约是对照组的10.2倍，显著高于对照组和其他各处理组；300mmol/L浓度下根尖K+净流速显著低于200 mmol/L处理，但高出对照组275.76 pmol/(cm2·s)，约是对照组的6.2倍；400 mmol/L处理组根尖的K+净流速下降为143.93 pmol/(cm2·s)，比对照组高91.13 pmol/(cm2·s)，差异显著。

2.2.3 盐胁迫对百合根尖Ca2+净流速的影响 由图2可看出，百合根尖Ca2+在对照和处理组中流向与Na+和K+相反，均表现为内流。流速随着盐处理浓度的增加，在100 mmol/L浓度处理下，根尖Ca2+平均净流速为-15.57 pmol/(cm2·s)，与对照组相差20.54 pmol/(cm2·s)，差异显著；200 mmol/L时Ca2+内流速度大幅度上升，平均流速为-93.84 pmol/(cm2·s)，约是对照组的2.6倍；300 mmol/L浓度下Ca2+流速有所波动，但幅度不大，此时平均流速显著高于对照组及其他处理组，净流速最高可达-116.29 pmol/(cm2·s)，约是对照组的3.2倍；400 mmol/L时处理组的Ca2+净流速急剧下降为-5.76 pmol/(cm2·s)，与对照组相差30.35 pmol/(cm2·s)，差异显著。

图2 不同浓度NaCl处理24 h后百合根尖Na+、K+、Ca2+流速变化(左)及平均流速与流向(右)Fig.2 The flux rates of Na+ , K+, Ca2+in the root tip of lily after 24 h treatment with different NaCl concentrations

3 讨论与结论

植物在感受到盐胁迫后，需氧细胞会在代谢过程中产生一系列的活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)，造成膜质过氧化，从而改变了细胞膜原有的流动性和通透性，进而使细胞结构和功能发生变化，最终导致植物生理代谢紊乱[15]。但是，植物在长久的进化过程中形成了一套完整的活性氧清除系统，SOD能够清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受生物氧毒害，其活性高低间接反映了植物体清除氧自由基的能力[11]；POD具有消除过氧化氢毒性的作用；CAT能够分解过氧化氢，从而避免植物受到活性氧毒害；MDA则可以在一定程度上反映植物遭受逆境伤害的程度，间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[16]。在本试验中，百合的SOD、POD、CAT活性随着盐浓度的增大、胁迫时间的延长基本呈现先上升后下降的趋势，而MDA含量持续上升，这与华智锐[12]在研究百合对盐胁迫的生理反应中得出的SOD、POD和CAT活性随着盐胁迫时间的延长先上升后下降，同时MDA水平逐渐上升的结果相一致。并且在亚麻荠[17]、茄子[18]、枸杞[19]、藜麦[20]等植物的耐盐性研究中，也有相似的变化趋势。本试验中，根系在盐处理第3天和第6天时，随着盐浓度的加大，MDA含量增加但比较缓慢，SOD、POD、CAT活性均显著上升，说明百合根系在感受到盐胁迫后，根系细胞膜质可能发生过氧化，抗氧化酶系统被激活，三者协同作用，适应逆境，来维持植株正常的生理代谢。臧剑等[21]研究也表明，盐胁迫下角果木根部SOD和POD活性随盐浓度的增加而上升，随着胁迫时间的延长呈先升后降的趋势；在金盏菊和万寿菊[22]的耐盐性试验中，也有相似的结果。综合说明盐胁迫可以促使植物SOD和POD活性上升，从而提高植物抗盐能力[23]。但盐处理第3天和第6天，盐浓度超过300 mmol/L后，酶活性基本上有不同程度的下降；盐处理第9天时，各个盐浓度下三种酶活性比第6天均有明显下降，同时第9天、400 mmol/L盐处理时MDA含量迅速增加，说明长时间高浓度盐胁迫导致的活性氧累积可能超出百合根系的自我清除范畴，细胞膜受损，抗氧化酶系统可能遭受破坏。此外，在受到盐胁迫后百合叶片的SOD、POD、CAT活性以及MDA含量与根系表现出相似的变化趋势，但是又不如根系变化剧烈，说明根系直接接触土壤，在受到盐胁迫后，根系比叶片更敏感，更快作出反应。

盐胁迫条件下，植物对盐分离子的吸收积累和再分配与盐胁迫造成的伤害有密切关系[24]。Na+是盐胁迫的主要毒害离子，它的吸收、运输以及区域化存储与植物在盐胁迫下能否正常生长发育息息相关；K+外流则与质膜去极化密切相关，而Na+和K+的一系列活动可触动Ca2+通道引起Ca2+内流，从而使细胞内Ca2+浓度升高来激活盐超敏感(Salt overly sensitive, SOS)信号途径，后通过Na+/H+反向运输体排出Na+[25]。在本试验中，低盐胁迫下，随着盐处理浓度的升高，百合根系Na+、K+均表现为外流，且流速逐渐上升，这与郭鹏[14]、李广鲁[26]、王晓东[24]等关于盐胁迫对紫花苜蓿、冰叶日中花、不同小麦品种等植物根系Na+、K+流速影响的研究结果相一致。200 mmol/L盐处理下，Na+、K+外流速度达到最大，随后下降，400 mmol/L时，下降幅度较大，但仍显著高于对照组，此外，K+的流速要整体低于Na+。说明低盐胁迫下，植物细胞通过促进Na+外流，同时减少K+外流等的跨膜流动，来调节Na+/K+，达到新的离子平衡，从而提高其耐盐性[27]；而高盐胁迫下离子流速降低，可能是由于细胞膜受损，离子平衡调节能力下降。Ca2+是植物细胞内重要的信号物质，盐胁迫下胞外Ca2+向细胞内流动，细胞内Ca2+浓度呈线性增加，进而调控Na+和K+的跨膜流动[28]。在本试验中，Ca2+表现为内流，且随着盐胁迫浓度的升高流速加大，在300 mmol/L浓度处理下流速最大，表现最为明显；而400 mmol/L盐浓度处理下，Ca2+内流速度同样降低，但要显著低于对照组，这与Na+和K+在此浓度下的流速表现有所不同，说明Ca2+同样在盐胁迫后百合根尖细胞离子吸收和交换中起着重要作用，但具体的调控机制仍需进一步研究。

综上，百合耐盐能力与SOD、POD、CAT的活性高低密切相关，在不同浓度和时间盐处理下，百合在300 mmol/L及以下浓度盐处理下抗氧化酶系统被充分激活，SOD、POD、CAT活性明显提高，三者协同作用来提高植株的耐盐性，继续增加盐浓度，酶活性反而下降，抗氧化酶系统可能受损。而MDA含量随盐处理浓度升高持续上升，也反映出百合受到盐胁迫后细胞膜的受损程度，这与盐胁迫下百合根尖Na+和K+表现为外流、Ca2+表现为内流，同时流速均先增大后减少的离子跨膜流动变化趋势相互验证，说明高浓度盐胁迫下，百合根尖细胞膜可能受损，离子交换受阻，植株的自我调节能力下降。Na+、K+和Ca2+跨膜运输对百合根系受到盐胁迫后重建离子平衡、缓解离子毒害来提高植株耐盐性有重要作用。本次试验为进一步研究百合耐盐机制提供了理论依据，同时可以在此基础上对百合进行耐盐锻炼，逐步提高百合的耐盐性，以筛选出更加耐盐的优良品种，对百合耐盐品种选育具有重要意义。