水蜜桃疏果多酚类物质提取及抗氧化活性研究

杨立风，马超，张明，王崇队，范祺，张博华，孟晓峰，窦勇博,2，吴茂玉*

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南 250014；2.齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东济南 250353）

植物多酚是具有芳香环及羟基取代基的天然化合物的总称，是植物重要的次级代谢产物之一[1]。新陈代谢过程中人体内会产生大量的活性氧簇，过多将会损伤机体细胞及组织[2-3]，进而引发各种疾病。植物多酚因具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、预防心脑血管疾病以及抗肿瘤等生理活性[4-6]，已被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域[7]。

水蜜桃（Prunus persicaL.Batsch）果实肉甜汁多，口感细腻，营养丰富，深受消费者喜爱。然而水蜜桃坐果率较高，容易导致果实因营养竞争性而变小、变形[8]，为保证整体产量及质量，需要疏除部分幼果以合理调节果树负荷[9-10]。疏果中营养及功能成分多样，尤其多酚类含量显著高于成熟果。有研究显示苹果[11]和桃[12]疏果中多酚类物质含量可达成熟果的10 倍左右。据统计，山东、河北、浙江等地区的水蜜桃疏果量约为100 kg/667 m2[13]。而目前国内针对水蜜桃疏果的研究较少，因此开展水蜜桃疏果中多酚类物质研究，对果树资源的综合利用和经济附加值的提高具有重要意义。植物中功能性成分的提取多采用超声辅助提取技术，该技术主要是利用机械效应、空化效应以及热效应来激发分子高速运动，使植物细胞组织结构破裂从而释放出内含物[14]。本研究采用超声波辅助提取法，以多酚提取得率（extraction yield of polyphenols，EP）、黄酮提取得率（extraction yield of flavonoids，EF）为考察指标，对超声波辅助提取工艺进行了优化，并采用2,2-二苯代苦味酰基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法对提取物抗氧化活性进行了研究，以期为果树下脚料资源在食品、化妆品等领域的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水蜜桃疏果，2017 年5 月采集于山东省临沂市蒙阴县；没食子酸标准品、福林酚试剂、DPPH 自由基，购于上海麦克林生化科技有限公司；芦丁标准品，购于北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、甲醇等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ME204E/02 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-250B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；DLSB-5/20 型低温冷却液循环泵，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SB-1100 型水浴锅，N-1100 型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；FD-2 型真空冷冻干燥机，上海比郎仪器制造有限公司；Vortex-3 型旋涡混合仪，上海嘉鹏科技有限公司；UV1000 型单光束紫外/可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 材料处理

新鲜水蜜桃疏果经切片、真空冷冻干燥后，粉碎过筛（40 目）得到水蜜桃疏果粉，密封避光保存。

1.3.2 水蜜桃疏果多酚提取工艺

准确称取一定量的水蜜桃疏果粉，采用水醇体系超声（800 W）辅助提取法提取水蜜桃疏果多酚，利用单因素及正交试验确定适宜的提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度，提取液经离心（3 000 r/min、5 min）、过滤、浓缩、真空冷冻干燥后，制得水蜜桃疏果多酚提取物。

1.3.3 没食子酸标准曲线绘制

采用Folin-Ciocalteus 法[15]，利用紫外/可见分光光度法，测定反应体系于760 nm 处的吸光度。以没食子酸质量浓度c（μg/mL）为横坐标、吸光度A（Abs）为纵坐标进行线性分析，得回归方程。

1.3.4 芦丁标准曲线绘制

采用NaNO2-Al(NO3)3法[16]，利用紫外/可见分光光度法，测定反应体系于510 nm 处的吸光度，以芦丁质量浓度c（μg/mL）为横坐标、吸光度A（Abs）为纵坐标进行线性分析，得回归方程。

1.3.5 疏果多酚提取物清除DPPH 自由基活性评价

采用DPPH 自由基清除法[17-18]，准确量取样品溶液2 mL，加入400 μmol/L DPPH 溶液2 mL，于30 ℃暗室维持反应30 min，以2 mL 去离子水为对照、2 mL 甲醇为空白，利用紫外/可见分光光度法，测定反应体系于517 nm处的吸光度，计算自由基清除率及IC50值。

式中：A1-样品，A2-对照，A3-样品空白，A4-DPPH 空白。

1.3.6 单因素对水蜜桃疏果EP 及EF 的影响

采用超声波（800 W）辅助提取法，分别选择提取温度（30、40、50、60、70 ℃）、提取时间（15、30、45、60、75 min）、料液比（1：20、1：30、1：40、1：50、1：60 g/mL）、乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）进行单因素试验，依据1.3.2 方法进行提取，参考1.3.3 及1.3.4 分别考察各因素对水蜜桃疏果EP 及EF 的影响。

1.3.7 正交试验设计

在单因素试验结果的基础上，选择提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度四个因素（见表1），以水蜜桃疏果EP 及EF 为考察指标，进行L9(34)正交试验优化多酚的提取工艺条件。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factor-level table of orthogonal test

1.4 数据统计

采用SPSS 软件进行数据统计及方差分析。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

采用Folin-Ciocalteus 法，绘制没食子酸标准曲线，得回归方程：A=0.040 9c+0.054 3（R2=0.999 6）。

2.2 芦丁标准曲线

采用NaNO2-Al(NO3)3法，绘制芦丁标准曲线，得回归方程：A=0.006 7c+0.003 2（R2=0.999 9）。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取温度对水蜜桃疏果EP 及EF 的影响

由图1 分析可知，随着提取温度的升高，水蜜桃疏果EP 呈现先增加至趋于平缓后再下降的趋势；低于40 ℃时，EF 随温度升高而下降，高于40 ℃时，EP 同样呈现先增加趋于平缓后再下降的趋势；50 ℃时，EP 及EF 均相对较高，分别为0.71%±0.06%与1.74%±0.01%。由于随着温度的升高，脂溶性杂质溶解度增大，多酚类物质在高温时易被氧化变质，故选择50 ℃作为最适提取温度。

2.3.2 提取时间对水蜜桃疏果EP 及EF 的影响

由图2 分析可知，随着超声提取时间的延长，EP 呈现先增加后下降的趋势，超声提取30 min 时，EP 相对较高，可达0.64%±0.12%，超过30 min，EP 有所下降；同时，EF 呈现先增加后趋于平缓的趋势，超声提取60 min 时，EF 可达1.80%±0.11%，之后增加不明显。分析其原因，可能由于作用时间过长，致使脂溶性杂质竞争性溶出以及多酚类物质被部分氧化修饰[19]。同时为缩短生产周期，降低能耗，节约成本，因此选择30 min 作为工艺优化的最适提取时间。

2.3.3 料液比对水蜜桃疏果EP 及EF 的影响

由图3 可知，随着料液比的增加，EP 呈现先增加后略微下降的趋势，料液比超过1：50（g/mL），EP 有所下降；1：50（g/mL）时，EP 相对较高，为0.73%±0.14%。EF 同样呈现先增加后趋于平缓的趋势，料液比为1：50（g/mL），EF可达1.89%±0.04%，之后增加不明显。可能由于提取溶剂增加导致杂质溶出增多，故综合考虑EP、EF 及提取成本，可选择1：50（g/mL）作为最适料液比。

2.3.4 乙醇浓度对水蜜桃疏果EP 及EF 的影响

由图4 可知，随着乙醇浓度的增加，EP 及EF 均呈现先增加后下降的趋势，乙醇浓度超过60%均有所下降，浓度为60%时EP 及EF 均相对较高，分别为0.64%±0.03%与1.80%±0.10%。可能是由于乙醇浓度低于60%时，水醇体系利于破坏酚类物质与多糖、蛋白质间氢键及疏水作用力，增加浓度则有助于多酚溶出释放；而乙醇浓度超过60%，溶剂与多酚间极性差异扩大，从而导致EP及EF 下降[20]。故选择60%作为最适乙醇浓度。

2.4 正交试验结果与分析

由表2（见下页）中极差分析结果可知，各影响因素对EP 的影响次序为A＞D＞B＞C，对EF 影响次序为D＞A＞B＞C，其中料液比对EP 及EF 影响均相对最小；进一步对提取温度、提取时间、乙醇浓度进行方差分析（见下页表3），由分析结果可知，各影响因素对EP 及EF 均未达到显著水平，F值分析结果显示，各影响因素对EP 及EF的影响次序均为D＞A＞B，与EF 极差分析结果一致；其中乙醇浓度为影响水蜜桃疏果多酚提取的最主要因素，直观表现最优组合为A2B3C1D2（EP，0.68±0.01%）与A3B1C3D2（EF，1.95±0.00%）。经综合k值、K值及方差分析结果得出理论最优组合为A3B2C1D2与A3B2C3D2。经验证试验（见下页表4），得出A3B2C3D2的EP、EF 分别为0.71%±0.02%和1.91%±0.03%，均高于其他组合。综上考察，确定最佳提取工艺参数为提取温度60 ℃、提取时间30 min、料液比1：60（g/mL）、乙醇浓度60%。

2.5 疏果多酚提取物对DPPH 自由基的清除活性

DPPH 法即利用分光光度法测定特征吸收峰吸光度的下降程度来评价抗氧化剂清除自由基的能力[21]。以水蜜桃疏果粉为原料，于最佳提取工艺条件下，制得水蜜桃疏果多酚水醇提取液，经浓缩、真空冷冻干燥后得水蜜桃疏果多酚提取物，进行DPPH 自由基清除率测定，结果见图5（见第19 页）。由图5 可知，水蜜桃疏果多酚提取物对DPPH 自由基的清除率随质量浓度的增加而增加，呈浓度依赖性，最大清除率可达88.87%；水蜜桃疏果多酚提取物对DPPH 自由基清除率在36.18%～88.87%范围内呈线性相关（y=62.673x+12.207），其半数抑制浓度IC50为0.60 mg/mL。

表2 正交试验设计及结果Table 2 The design and results of orthogonal test

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results

表4 验证试验结果Table 4 Results of verification experiment

3 结论

本研究以水蜜桃疏果为原料，采用超声波辅助提取法，以EP 及EF 为考察指标，通过单因素及正交试验优化水蜜桃疏果多酚的提取工艺，得到最优提取条件为提取温度60 ℃、提取时间30 min、料液比1：60（g/mL）、乙醇浓度60%；其中乙醇浓度是最主要的影响因素。此条件下水蜜桃疏果EP 及EF 均最，高分别可达0.71%±0.02%与1.91%±0.03%，且提取物显示较强的DPPH 自由基清除能力，最高可达88.87%，IC50为0.60 mg/mL。可见，水蜜桃疏果多酚提取物具有较好的抗氧化效果，这为其进一步分离纯化、结构鉴定、活性评价以及深度开发利用提供参考依据。