油松胚性愈伤组织成熟培养的影响因素1)

李亦轩 江帅菲 董明亮 齐帅征 张金凤

(林木育种国家工程实验室(北京林业大学)，北京，100083)

油松(PinustabulaeformisC.)为松科针叶常绿乔木，是我国特有的树种，也是我国华北、东北等地区主要的造林树种和用材树种。油松用途广泛，具有良好的经济价值，生态价值和观赏价值；并且油松抗瘠薄、抗风，适应恶劣环境的能力强，在我国的生态建设中发挥了非常重要的作用[1]。但是，到目前为止，油松的繁殖效率还很低，存在生长周期长、有性繁殖后代变异较大、扦插等无性繁殖生根率低等问题；同时，虫害和各种疾病又造成了油松种子产量的下降。因此，需要一种新方法来提高油松优良材料的繁殖效率。

体细胞胚胎发生技术是一种大规模繁殖的有效方法[2]，外植体在特定条件下，未经性细胞融合而是经过了一个与合子胚胎发生类似的过程，发育形成具有双极性的胚状结构的过程[3]。体细胞胚胎发生可以作为大规模繁殖的有效方法，特别是对于使用常规无性繁殖难以繁殖的优良基因型[2]。与其他传统的繁育方法相比，体细胞胚胎发生技术具有繁殖速度快、数量多、不受季节影响、优良性状后代能够稳定遗传等优点[4]。体细胞胚的成熟是体胚发生体系的关键环节之一，许多因素直接影响细胞的分化，进而影响体胚的产生。因此，筛选和优化油松体细胞胚成熟过程的影响因素尤为重要。

以现有的培养基和培养条件进行培养，油松胚性愈伤组织成胚率低，而在一些愈伤组织中甚至没有体胚的产生。为了最大程度发挥油松胚性愈伤的胚性，提高体胚的数量和质量，本研究对现有的培养基和培养条件进行了调整和优化，以油松胚性愈伤组织为试验材料，研究了成熟培养基中ABA质量浓度、PEG质量浓度、植物凝胶质量浓度、麦芽糖和蔗糖质量浓度对于体胚数量的影响，同时以成熟率对现有的培养基成分进行优化，希望能够筛选出最优的培养基，创造最佳的培养条件以提高油松体细胞胚成熟率，为油松的高效繁殖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以本实验室前期积累的胚性细胞系为材料[5]，选择增殖能力强，胚性比较好的胚性细胞系15c4b，16c4a等,见图1。

图1 油松胚性愈伤组织

1.2 试验方法

1.2.1 基础固体成熟培养基

使用针叶树基础培养基[6]，并添加酶水解酪蛋白0.5 g·L-1，pH调至5.8，谷氨酰胺0.5 g·L-1(过滤灭菌后加入)，含ABA 8 mg·L-1、PEG4000质量浓度50 g·L-1、植物凝胶3 g·L-1、蔗糖30 g·L-1。

1.2.2固体成熟培养基中4种影响因素水平的设置

成熟培养基中ABA质量浓度分别设置为6、10、14、18、22 mg·L-1；PEG4000质量浓度分别设置为25、50、75、100、125 g·L-1；在成熟培养基中依次添加1.5(能使培养基凝固的最少含量)、2.0、2.5、5.0、7.5 g·L-1的植物凝胶；在成熟培养基中添加麦芽糖和蔗糖两类糖，其质量浓度组合分别为：0+40、12.5+27.5、15+25、22.5+17.5、40+0 g·L-1，用装有剪去尖端枪头的移液枪吸取等量的悬浮愈伤组织喷撒在固体成熟培养基表面，吸去多余水分，在黑暗环境中培养7～8周后统计体胚的数量，每个单因素试验重复3次。

1.3 正交设计与验证

利用正交试验设计，以ABA质量浓度、PEG质量浓度、植物凝胶质量浓度、糖的种类和质量浓度4个因素的单因素分析最优结果为中心值，上下各挑选1个梯度值共3个水平，采用L9(34)正交设计开展试验，选出最优组合，试验重复3次。

为了验证调整后的培养基的成胚效果，7～8周后分别统计原培养基与调整后的培养基体胚的数量。

1.4 数据分析

培养7～8周以后，对每盘体胚的数量进行统计，结果取平均值±标准差。使用Microsoft Excel和SPSS19.0软件对数据进行分析，利用最小显著极差法(LSD)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 成熟培养基中ABA、PEG、植物凝胶和糖类对体胚数量的影响

从表1中可以看出随着成熟培养基中ABA质量浓度的增加，体胚的数量呈现上升的趋势，当增加到一定浓度的时候，体胚的数量呈下降的趋势。综合来看，成熟培养基中ABA质量浓度为14～18 mg·L-1时，其诱导体胚的效果显著，尤其在18 mg·L-1时，体胚的数量最高。

当成熟培养基中PEG的质量浓度为25 g·L-1时，体细胞胚的数量较低，随着PEG质量浓度的升高，体胚的数量明显上升，在PEG浓度为50～100 g·L-1时，成胚的效果最明显。综合来看，培养基中添加75 g·L-1PEG时，获得的体胚的数量最高。

随着植物凝胶含量的增加，体细胞胚的数量呈逐渐升高的趋势，当植物凝胶为7.5 g·L-1时，体胚的数量下降。综合来看，成熟培养基中植物凝胶质量浓度为2.5～5.0 g·L-1时，对体胚的形成影响最好，在植物凝胶浓度为5.0 g·L-1时，体胚的数量最高。

从表1中结果可得知随着麦芽糖和蔗糖质量浓度的变化，体胚的数量呈现上升的趋势；当增加到一定浓度时，体胚的数量有所下降；综合来看，当成熟培养基中麦芽糖和蔗糖质量浓度为(15+25)g·L-1，对成胚的效果较好。

表1 不同质量浓度ABA、PEG、植物凝胶和糖类对体胚数量的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

2.2 正交试验结果

根据上述结果，选出4个因素最优范围内3个水平进行正交试验，7～8周后愈伤组织产生体胚的数量如表2和表3所示。2号处理组产生体胚的数量最多，平均每克胚性愈伤组织可以得到35.6个体胚；9号处理组获得的体胚数量最低，仅为12个。极差分析显示，本试验最优组合为ABA质量浓度为16 mg·L-1，PEG质量浓度为75 g·L-1，植物凝胶质量浓度为5 g·L-1，麦芽糖和蔗糖质量浓度为10+30 g·L-1。方差分析(表4)的结果显示，在0.05水平下，ABA、PEG、植物凝胶和糖类配比对成熟体细胞胚的数量具有显著影响，其中ABA影响最为显著，其次为PEG、糖类；植物凝胶影响不显著。

表2 ABA、PEG、植物凝胶和糖类对体胚数量影响的正交试验结果

编号ABA质量浓度/mg·L-1PEG质量浓度/g·L-1凝胶质量浓度/g·L-1麦芽糖+蔗糖质量浓度/g·L-1体胚数量/个·g-1116603.010+3030.0±2.86216755.015+2535.6±6.79316907.020+2014.0±1.24418605.020+2017.3±1.69518757.010+3026.3±4.10618903.015+2515.0±2.94720607.015+2514.0±5.01820753.020+2015.0±6.16920905.010+3012.0±2.49

注：表中数据为平均值±标准差。

2.3 优化培养基验证

从图2和图3中可以看出随着培养时间的增加，体胚的数量也逐渐增加，调整后的培养基体胚的数量明显大于原培养基中体胚的数量，在第9周，优化培养基上体胚数量可达51个/g，原培养基为27个/g，提高了0.8倍。另外，与原培养基相比，调整后的培养基上出现体胚的时间较早，从第5周就出现体胚，且体胚增加速度更快，所以调整后的成熟培养基成分更有利于体胚的产生。

表3 ABA、PEG、植物凝胶和糖类对体胚数量影响的正交试验极差分析

指标各因素不同梯度时测定的体胚数量/个·g-1ABA质量浓度PEG质量浓度凝胶质量浓度麦芽糖+蔗糖质量浓度K126.520.4320.022.76K219.525.6321.621.53K313.613.6018.115.43R12.912.033.57.33

注：最优组合为ABA质量浓度为16 mg·L-1、PEG质量浓度为75 g·L-1、植物凝胶质量浓度为5 g·L-1、麦+蔗糖质量浓度为(10+30)g·L-1。

表4 油松体胚成熟培养基试验方差分析

注：*表示在P<0.05水平差异显著。

A.成熟培养基中体细胞胚生长状态；黑色箭头表示油松体细胞胚；B.体式显微镜下观察到的成熟培养基体细胞胚状态，箭头表示胚柄和胚头。

图2 油松体细胞胚生长状态

图3 培养基调整前后体胚数量的统计

3 结论与讨论

油松体细胞胚胎发生是一个相对复杂的过程，其中成熟阶段是最为重要的一个环节，受到许多因素的影响，例如成熟培养基的成分，培养环境的温度，外源激素的种类与浓度，继代周期的长短，细胞系的胚性以及母树基因型来源等[7]。本文探究了ABA质量浓度、PEG质量浓度、植物凝胶及糖的种类和质量浓度对油松体细胞胚成熟率的影响。

油松细胞系在增殖过程中，培养基上残留的植物生长调节剂2,4-D和6-BA对成熟阶段体细胞胚的产生会造成影响[8]，所以油松愈伤组织材料在进入成熟培养之前，要先进行预处理，其目的就是除去材料上吸附的植物生长调节剂。本试验采用悬浮培养的方式处理试验材料，除了提高植物材料的利用率以外，也能够使材料与液体培养基充分接触。

ABA在许多物种体细胞胚胎发生过程中起到非常重要的作用，尤其是针叶树[9]。已经有研究证明，在成熟培养基中添加适量浓度的ABA能够显著提高胚性愈伤组织成胚率和质量[10]，杜克久等在山茶花体胚发生体系的研究中，添加ABA后山茶花体胚可达70-75%[11]。在其他有关针叶树体胚成熟的研究中，宋跃等报道了有关长白落叶松体细胞胚胎发生的初步结果，结果表明ABA的质量浓度和渗透压的改变，对落叶松体细胞胚的影响显著，最佳数量可达(204±4)g-1[12]。本试验结果也表明在探索影响成熟阶段体细胞胚胎发生的几个因素中，ABA对其成胚的影响最为显著。ABA在外植体进行组织培养时，能够减少植物组织产生的裂生多胚的数量，使组织胚胎分散成单个胚，即起到了使胚从增殖生长状态向成熟状态转变的作用[13]。适宜的ABA能够改善愈伤组织的状态，使其结构细密，逐渐失水保持干燥[14]，提高体细胞胚的质量，减少畸形胚，提高成胚率[15]，这可能与体细胞胚胎发生过程中一些特定表达的基因有关[16]。

针叶树体细胞胚胎发生也受碳水化合物的类型和浓度的影响[17-18]。在华北落叶松的体细胞胚胎发生的过程中，蔗糖的质量浓度会显著影响体细胞胚的质量和数量[19]；云杉的体细胞胚胎发生过程中，过高浓度的蔗糖不利于体细胞胚的发生[18]；与蔗糖相比，麦芽糖更有利于火炬松体细胞胚胎的发生[20]，用麦芽糖代替蔗糖，不仅显著提高了体细胞胚成熟率,而且使体细胞胚发生时间提前一周；与蔗糖相比，在麦芽糖中体细胞胚质量明显改善，体细胞胚体积小，大小均一，畸形胚很少[21]。本研究中可以看到，与同时含有麦芽糖和蔗糖的处理组相比，单只含有一种糖类的处理组得到的成熟体细胞胚的数量小于前者，这说明在体细胞胚胎成熟过程中，同时添加麦芽糖和蔗糖有利于体细胞胚数量的提高。麦芽糖除了提供体胚发生过程中的碳源和能量外，也会对体细胞胚胚柄的生长有一定程度的抑制作用[17]；在只含蔗糖的培养基上培养时，会出现胚柄过度生长，抑制胚头的生长发育等现象，造成体细胞胚畸形，甚至死亡，最终降低成胚率，用麦芽糖代替蔗糖时，这种现象的发生率降低[17，22]。

已有的研究表明PEG对培养基调节培养基的渗透压，且经PEG处理的愈伤组织细胞的活力和有丝分裂能力均较高，有利于后续成熟培养[23]。齐力旺等对华北落叶松体细胞胚胎发生的研究发现，添加75 g·L-1PEG4000每克愈伤组织得到82.7个子叶胚[24]。本研究发现，PEG4000浓度过高或过低都会影响体胚的数量，PEG4000在75 g·L-1时体胚数量最多。以上结果说明在针叶树体细胞胚胎发生中发挥重要作用。

植物凝胶的含量多少对培养基的软硬程度有影响。当含量过多时，培养基过于坚硬，不仅会影响胚性愈伤组织生长状态，组织表面干化，呈结晶状，影响组织转向成熟状态的发育，而且会影响体细胞胚的形态和生长状况；而植物凝胶含量过少时，胚性愈伤组织周围会有水份堆积，也会影响其胚性的发展。但是本研究发现，植物凝胶对油松体细胞胚的影响不显著，已有的研究，也未发现植物凝胶对油松愈伤组织有显著影响[5]，这与本研究结论一致。

针叶树的体细胞胚胎发生的成熟阶段是比较困难的，在愈伤组织增殖的过程中由于继代时间长，机械损伤等原因会造成胚性的丧失。不同的基因型细胞系的胚性也不尽相同，所以在成熟培养阶段，要根据细胞系的胚性状况，合理的调节和改进成熟培养基的成分，一般可以得到较好的效果，为了选着出最适的成分配比本研究在单因素分析的基础上开展了正交设计试验及验证，当ABA质量浓度14～18 mg·L-1、PEG质量浓度为50～100 g·L-1、植物凝胶质量浓度为2.5～5.0 g·L-1、麦芽糖和蔗糖质量浓度为(15+25)g·L-1时，进一步提高了体胚的成熟率，为油松的大规模繁殖提供了技术基础，并为后续油松基因工程遗传转化，提供了材料和技术平台。