马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫SCAR标记的建立及应用

郭木娟，陈诗敏，庾家琪，叶翠怡，邱宝利，李文香，潘慧鹏*

(1.华南农业大学农学院/广东省生物农药创制与应用重点实验室/广东省农业害虫生物防治工程技术研究中心，广州 510642；2.河北北方学院农林科技学院，河北张家口 075000)

马铃薯瓢虫Henosepilachnavigintioctomaculata(Motschulsky)和茄二十八星瓢虫Henosepilachnavigintioctopunctata(Fabricius)均被称为二十八星瓢虫，属鞘翅目瓢虫科。马铃薯瓢虫以成虫越冬，多分布在我国北方地区，其成虫体形为半球形、赤褐色，各鞘翅上均具有14个黑斑(郭文英等，2005)，其主要为害的经济作物有马铃薯、茄子、番茄及辣椒等茄科蔬菜，但以危害马铃薯为主(高芳瑞，2018)。茄二十八星瓢虫的外形与马铃薯瓢虫相似度极高，危害的农作物种类也几乎相同，但茄二十八星瓢虫以危害茄子为主，分布的范围更为广泛(张晓宁和欧晓红，2010)。两种瓢虫的幼虫及成虫均以叶片为食，初孵幼虫主要群集于叶片背面取食叶肉，幼虫稍大后扩散危害，受害叶片通常形成不规则透明斑或穿孔，后期变为褐色凹陷斑痕。此外，嫩茎、花瓣、萼片、果实等也会受其危害，导致植株产量下降、果实品质不佳或植株枯死，严重影响马铃薯、茄子等农作物的经济价值(宋萍等，2008；王婧瑜等，2018)。

虽然有文献提出利用二十八星瓢虫外表形态在细微结构上的区别来鉴定马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫的方法(王波，2012)，但是这两种害虫外部形态的区分对于非昆虫分类专业人员来说仍比较困难。近几年来，随着气候变暖、贸易发展及种植业结构的调整，马铃薯瓢虫和茄二十八星瓢虫的危害越发严重，发生范围有扩大蔓延的趋势(Lüetal.,2019)。然而这两种二十八星瓢虫经常被人们混为一谈，导致难以制定针对性的田间防治方案，因此寻找一种能快速区分马铃薯瓢虫及茄二十八星瓢虫的方法十分有必要。

序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)是基于随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)发展而来，经过对RAPD标记技术所扩增的目的片段进行克隆、测序并分析序列，而后根据测序结果设计出来的稳定性标记(黄茜等，2016)。Paran等(1993)首次提出SCAR标记技术后，近二十多年来SCAR标记技术被广泛地应用于不同研究领域。其中，在昆虫的种类鉴定方面也被广泛应用，例如，王金娜等(2012)利用SCAR标记技术筛选出能准确鉴定温室白粉虱Trialeurodevaporariorum的特异性引物；孟祥钦等(2010)通过SCAR标记技术确立了快速鉴定西花蓟马Frankliniellaoccidentalis的分子生物学方法。与其它分子标记方法相比，SCAR标记具有稳定性高、操作简便、特异性强等优点(马丽娜等，2017)。

本研究通过对马铃薯瓢虫及茄二十八星瓢虫进行RAPD扩增，找到两种二十八星瓢虫中具有的特异性扩增条带后，通过切胶回收、克隆及测序后设计SCAR标记引物，从而在分子水平上建立快速区分马铃薯瓢虫和茄二十八星瓢虫的方法，该鉴定方法高效便捷，且对二十八星瓢虫的田间精准性防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试虫

马铃薯瓢虫2018年5月采于河北省张家口北方学院的教学基地，经形态学鉴定，确定为马铃薯瓢虫；茄二十八星瓢虫2018年4月采自华南农业大学校园内的龙葵上，经形态学鉴定，确定为茄二十八星瓢虫。

1.2 供试试剂

随机引物采用生工生物工程(上海)股份有限公司的RAPD通用引物系列，分别为OPH、OPI、OPJ，每个系列的引物各20条。特异性引物合成以及DNA序列测序均委托广州擎科生物技术有限公司完成。PCR扩增中所用到的2XPCR Taq MasterMix购自abm生物科技有限公司，DNA提取所用试剂盒、DNA纯化回收所用的试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司、克隆试剂盒购自TAKARA生物技术有限公司；DNA标准Maker购自深圳辉诺生物科技有限公司。

1.3 单头马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫DNA提取

单头马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫成虫DNA提取使用DNA提取试剂盒，DNA浓度用微量核酸浓度测定仪测定，放置-20℃保存备用。

1.4 RAPD扩增

分别以两种二十八星瓢虫的DNA溶液作为模板，利用合成的60条随机引物进行PCR扩增，两种瓢虫分别设置4个重复，以确保筛选出稳定的特异性条带。PCR扩增体系为20 μL，其中包括6 μL ddH2O、10 μL 2XPCR Taq MasterMix、1 μL DNA模板及3 μL RAPD引物(10 mM)。PCR反应程序为：首先进行94℃预变性4 min，之后进行40个循环(包括94℃变性1 min、37℃退火50 s、72℃延伸95 s)，最后72℃延伸10 min。PCR程序反应完成后，从各样品的PCR扩增产物中吸取5 μL 于1%琼脂糖凝胶上进行电泳(120 V,20 min)，并利用凝胶成像分析仪对结果进行分析，明确特异性扩增的条带。

1.5 特异性扩增产物的回收克隆

对经RAPD扩增后在两种二十八星瓢虫中获得的特异性条带，采用DNA纯化回收试剂盒对其进行纯化回收。然后使用克隆试剂盒，根据说明书步骤，将纯化回收的目的片段连接到PMD-18T载体上，并转化到JM109感受态细胞中，37℃过夜培养，挑白色阳性克隆于10 μL ddH2O中作为模板，利用通用引物M13(F:5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′,R:5′-CACACAGGAAACAG CTAT-3′)进行PCR扩增验证目的条带，根据电泳结果确定目的条带成功连接到PMD-18T载体上后，将具有目的条带的模板加入5 mL含Amp的LB培养基中过夜振荡培养(200 rpm,37℃)，将菌液送广州擎科生物技术有限公司进行测序。

1.6 SCAR引物设计及PCR扩增

基于测序结果，在https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index网页上设计SCAR标记特异性引物，并利用所提取的马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫的DNA作为模板，验证所设计引物的特异性。PCR反应体系为20 μL，其中包括去离子水7 μL、2XPCR Taq MasterMix 10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL及DNA模板1 μL。PCR反应程序为：首先进行94℃预变性3 min，之后进行35个循环(包括94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min)，最后72℃延伸10 min。扩增反应在PCR仪上进行，反应产物同样使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 RAPD扩增

在60条随机引物中，引物OPI-6(AAGGCGGCAG)在马铃薯瓢虫中扩增到一条约为750 bp的条带，而在茄二十八星中没有扩增到此大小的条带；另外，引物OPJ-15(TGTAGCAGGG)在茄二十八星中扩增到一条约为750 bp的条带，而在马铃薯瓢虫中没有扩增到此大小的条带。图1显示了OPI-6在马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫中的随机扩增结果图谱，图2显示了OPJ-15在马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫中的随机扩增结果图谱。

图1 引物OPI-6在两种二十八星瓢虫中的RAPD扩增图谱Fig.1 RAPD amplification profiles in two 28-spotted ladybeetles with primer OPI-6注：M，2 000 bp分子量标准；1-4，马铃薯瓢虫；5-8，茄二十八星瓢虫。Note:M,2 000 bp marker;1-4,H.vigintioctomaculata;5-8,H.vigintioctopunctata.

图2 引物OPJ-15在两种二十八星瓢虫中的RAPD扩增图谱Fig.2 RAPD amplification profiles in two 28-spotted ladybeetles with primer OPJ-15注：M，2 000 bp分子量标准；1-4，马铃薯瓢虫；5-8，茄二十八星瓢虫。Note:M,2 000 bp marker;1-4,H.vigintioctomaculata;5-8,H.vigintioctopunctata.

2.2 SCAR引物扩增

对经RAPD扩增在两种瓢虫中分别得到的特异性条带进行DNA切胶回收、克隆并测序后(表1)，根据测序得到的片段设计了两对SCAR引物，分别为OPI-6 test F:5′-CGTCTCGGGTCTAGAG AT-3′,OPI-6 test R:5′-GACATACCGCCCGATTAG-3′和OPJ-15 test F:5′-GGTATGGAGTATCACCAAT-3′,OPJ-15 test R:5′-ATTCCTCCGTATCTCTTTC-3′。经过PCR及凝胶电泳检测，确定根据OPI-6 test的测序结果所设计的SCAR引物仅能在马铃薯瓢虫中扩增出大小为645 bp的条带，而根据OPJ-15 test的测序结果所设计的SCAR引物仅能在茄二十八星瓢虫中扩增出大小为436 bp的条带。

2.3 SCAR引物灵敏度检测

经微量核酸浓度测定仪检测，单头马铃薯瓢虫DNA浓度为146.4 ng/μL，单头茄二十八星瓢虫DNA浓度为300.4 ng/μL，将这两种DNA溶液均依次稀释10倍作为模板，在马铃薯瓢虫中选取OPI-6 test引物，在茄二十八星瓢虫中选取OPJ-15 test引物，进行PCR扩增和检测，结果表明当马铃薯瓢虫DNA浓度稀释到103倍时仍能检测到目的扩增条带，而茄二十八星瓢虫DNA浓度稀释到104倍时仍可以检测到目的扩增条带，引物灵敏度分别达到0.1464 ng/μL和0.03004 ng/μL。图4显示了OPI-6 test在马铃薯瓢虫不同稀释倍数DNA中的扩增结果，图5显示了OPJ-15 test在茄二十八星瓢虫不同稀释倍数DNA中的扩增结果。

图3 两对SCAR引物在两种二十八星瓢虫中的扩增图谱Fig.3 The amplification profiles of two pairs of SCAR markers in the two 28-spotted ladybeetles注：M，2 000 bp分子量标准；1-2，OPI-6 test(1，马铃薯瓢虫；2，茄二十八星瓢虫)；3-4，OPJ-15 test(3，马铃薯瓢虫；4，茄二十八星瓢虫)。Note:M,2 000 bp marker;1-2,OPI-6 test (1,H.vigintioctomaculata;2,H.vigintioctopunctata);3-4,OPJ-15 test (3,H.vigintioctomaculata;4,H.vigintioctopunctata).

图4 OPI-6 test引物在马铃薯瓢虫不同稀释倍数DNA中扩增结果Fig.4 Amplification of Henosepilachna vigintioctomaculata with OPI-6 test under different DNA dilution series注：M，2 000 bp分子量标准；1，单头马铃薯瓢虫DNA原液146.4 ng/μL；2，DNA浓度稀释10倍；3，DNA浓度稀释102倍；4，DNA浓度稀释103倍；5，DNA浓度稀释104倍；6，DNA浓度稀释105倍。Note:M,2 000 bp marker;1,the concentration of original DNA of H.vigintioctomaculata was 146.4 ng/μL;2-6,represents 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 of the original DNA of H.vigintioctomaculata.

表1 OPI-6在马铃薯瓢虫与OPJ-15在茄二十八星瓢虫中特异性扩增子核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of the specific amplicons from OPI-6 in Henosepilachna vigintioctomaculata and OPJ-15 in Henosepilachna vigintioctopunctata

图5 OPJ-15 test在茄二十八星瓢虫不同稀释倍数DNA中的扩增结果Fig.5 Amplification of Henosepilachna vigintioctopunctata with OPJ-15 test under different DNA dilution series注：M，2 000 bp分子量标准；1，单头茄二十八星瓢虫DNA原液300.4 ng/μL；2，DNA浓度稀释10倍；3，DNA浓度稀释102倍；4，DNA浓度稀释103倍；5，DNA浓度稀释104倍；6，DNA浓度稀释105倍。Note:M,2 000 bp marker;1,the concentration of original DNA of H.vigintioctopunctata was 300.4 ng/μL;2-6,represents 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 of the original genomic DNA of H.vigintioctopunctata.

3 结论与讨论

本研究共筛选出两条可用于鉴别马铃薯瓢虫和茄二十八星瓢虫的RAPD引物，分别为OPI-6和OPJ-15。其中根据OPI-6扩增序列设计的SCAR引物OPI-6 test能在马铃薯瓢虫中扩增出大小为645 bp的条带，在茄二十八星瓢虫中无扩增条带；而根据OPJ-15扩增序列设计的SCAR引物OPJ-15 test能在茄二十八星瓢虫中扩增到大小为436 bp的条带，在马铃薯瓢虫中无扩增条带。马铃薯瓢虫和茄二十八星瓢虫的SCAR引物在其DNA的浓度很低时，仍能检测到目的扩增条带。所以，这两对SCAR引物能够准确且灵敏的区分两种二十八星瓢虫。

马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫均为我国重要的农业害虫，两者外形相似度极高，寄主植物也几乎相同，但对于寄主植物的嗜好不同，且对不同种的化学农药所表现的抗药性也不相同(张贵森等，2014；牛建群等，2016)。但目前，对于这两种瓢虫的防治，还是简单粗糙的采用同样的化学杀虫剂。随着近几年蔬菜种植面积的不断扩增，二十八星瓢虫在我国蔬菜种植区频繁爆发(魏鸿钧，1995；周雷等，2014)，严重影响马铃薯、辣椒及茄子等茄科蔬菜的经济效益。因此，准确区分这两种二十八星瓢虫，能够针对性地制定防治方案。但是，目前只有文献提出利用外表形态特征的细微差异对马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫进行鉴别(虞国跃，2000；张迎春等，2002)，利用该方法对两种二十八星瓢虫进行鉴别难度较大，且对于标本的完整程度有较高的要求。本文首次开发了快速鉴别马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫的分子生物学方法，该方法操作简单方便且对标本的完整性无要求，对二十八星瓢虫的精准防控有重要的意义。

本研究中所设计的两对SCAR引物在两种二十八星瓢虫中的扩增图谱单一，灵敏度高，且实验操作简单方便，鉴别准确且快速，成本较低。所以，该鉴别方法能够及时监测田间两种二十八星瓢虫的发生动态，掌握其发生规律，为制定精准防治方案提供技术支持。