热分离进样/气相色谱-质谱法测定橄榄油中脂肪酸乙酯

侯 靖，刘梦婷，卢跃鹏，王 澍，周玮婧

(武汉食品化妆品检验所，湖北 武汉 430012)

橄榄油的真伪及品质判别一直倍受关注，国际橄榄油协会标准COI/T.15/NC No 3/Rev.14及国际食品法典CODEX STAN 33-1981将橄榄油主要划分为初榨橄榄油和精炼橄榄油，其中初榨橄榄油要求采用机械压榨等物理方式直接从油橄榄果实中榨取油脂，并根据油脂的质量分为多个等级;对质量不符合要求的初榨橄榄油，可通过精炼的方式获得精炼橄榄油。品质不良及贮藏不当的橄榄果会发酵产生乙醇，从而与游离脂肪酸反应生成脂肪酸乙酯。因橄榄油中含有较高的棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等脂肪酸，所以主要生成棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯和亚油酸乙酯等。已有研究经感官评定发现有发酵缺陷的橄榄油中脂肪酸甲酯和乙酯的含量较高[1]，因此，国际橄榄油协会标准COI/T.15/NC No 3/Rev.14中规定特级初榨橄榄油中脂肪酸乙酯含量不得超过35 mg/kg，而欧盟标准(EU) No 1348/2013规定2015年后生产的特级初榨橄榄油中脂肪酸乙酯含量不得超过30 mg/kg。

目前，橄榄油中脂肪酸乙酯的检测普遍采用国际橄榄油协会的COI/T.20/Doc.No 31方法，但该方法使用硅胶层析柱净化，气相色谱法测定，需手动填装层析柱，操作繁琐费时，不利于大批量检测。已有文献报道的气相色谱法[2]及气相色谱-质谱联用法[3]虽大大简化了样品前处理步骤，减少了溶剂的使用，但其采用的固相萃取及氮吹浓缩依旧耗时费力。其他报道如Boggia等[4]以热解吸结合冷冻聚焦进样，气相色谱-质谱联用检测橄榄油中的脂肪酸烷基酯，方法无需前处理，但需加装热脱附和冷进样系统，不利于普及;Berardinelli等[5]采用时域反射计在线采集橄榄油的时域反射信号，再经过快速傅立叶转换等数据处理，对橄榄油中的脂肪酸烷基酯含量进行测定，但其得到的为多种脂肪酸乙酯的总量，并不能分析出每个化合物的具体含量。

热分离进样是一种通过气化温度差异直接分析固体及液体试样的技术，待测组分在进样口发生气化时，高沸点或不挥发的基质保留在一次性微量进样瓶中，从而实现待测物与基质的分离[6]。使用该技术只需将热分离进样杆适配器安装在进样口即可，对于分流/不分流进样口，需快速插入进样杆以避免样品过早气化[7]，可使用具有程序升温功能的进样口以避免该情况的发生。热分离进样技术已被用于固体样品中挥发性成分的检测[8]，如与微吸附采样技术结合应用于大气污染物的快速检测[9]，与吸附萃取搅拌棒联合使用用于火场空气中助燃剂的检测[10]以及枪支射击残留物的检测[11-12]。本研究首次采用热分离进样技术对橄榄油中的脂肪酸乙酯进行测定，可为橄榄油品质快速鉴别提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

7890B-7010气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)，配多模式进样口；万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Vortex-Genie 2涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司)；热分离进样套件及玻璃微量样品瓶购于美国Agilent公司。

正己烷(色谱纯，德国Merck公司)；标准物质：棕榈酸乙酯(Palmitic acid ethyl ester)、硬脂酸乙酯(Stearic acid ethyl ester)、油酸乙酯(Oleic acid ethyl ester)、亚油酸乙酯(Linoleic acid ethyl ester)、十七烷酸甲酯(Heptadecanoic acid methyl ester，内标)纯度均大于99%，购于上海安谱实验科技股份有限公司；特级初榨橄榄油质控样(材料代码：PT-FC-790-X，英国LGC公司)。精炼橄榄油(作为空白基质)及特级初榨橄榄油，均购自武汉市场。

1.2 溶液配制

1.2.1 脂肪酸乙酯混合标准溶液的配制分别准确称取棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯各100 mg(精确至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，配成质量浓度均为1 000 mg/L的混合标准储备液。临用时取10 μL，用正己烷定容至1 mL，配成10 μg/mL的脂肪酸乙酯混合标准工作液。

1.2.2 十七烷酸甲酯内标溶液的配制精密称取十七烷酸甲酯100 mg(精确至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，制成1 000 mg/L内标储备液。临用时取内标储备液10 μL，用正己烷定容至1 mL，得10 mg/L的十七烷酸甲酯内标溶液。

1.3 样品制备

精确称取0.1 g油脂样品于10 mL容量瓶中，加入100 μL十七烷酸甲酯内标溶液，用正己烷定容至刻度，涡旋振荡使样品充分溶解并混匀，再用移液枪吸取10 μL样品溶液至玻璃微量样品瓶中，室温放置约2 h，使溶剂自然挥发。将挥干溶剂的样品瓶放入热分离进样套件的样品杆内，并将进样杆插入进样口中，拧紧后开始进样分析。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件采用DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱1)连接进样口和反吹装置；采用空毛细管色谱柱(1 m×0.15 mm，柱2)连接反吹装置和质谱仪；不分流进样；进样口初始温度60 ℃，保持0.1 min，以600 ℃/min升温至220 ℃，保持至分析结束；载气为高纯氦气(纯度>99.999%)。柱1为恒流模式，流速1.2 mL/min；柱2为恒压模式，压力为34.47 kPa；程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，最后以 20 ℃/min升至280 ℃，数据采集结束后，再迅速升温至300 ℃进行反吹；反吹压力344.7 kPa，进样口压力关闭，反吹5 min；传输线温度300 ℃。

1.4.2 质谱条件电离方式为电子轰击源(EI)；电离能量70 eV；离子源温度280 ℃；溶剂延迟时间8 min；监测方式为选择离子监测(SIM)，各化合物CAS号、保留时间、定量及定性离子信息见表1。

2 结果与讨论

2.1 进样温度的选择

热分离进样主要利用目标物和基质的沸点差异进行分离，因此选择合适的进样口温度是方法建立的关键。实验先将载有微量样品瓶的进样口升温至某一温度进行数据采集，记录4种脂肪酸乙酯的峰面积；不取出微量样品瓶，继续将进样口温度升至300 ℃再次采集数据记录各化合物的峰面积，以第一次进样峰面积与两次进样峰面积之和的百分比为该温度下的进样率。结果显示，当进样口温度为200 ℃时，4种化合物进样率均低于90%；当进样口温度为220 ℃时，4种化合物进样率均在90%以上，且继续提高进样温度，进样率提升不明显；考虑到进样口温度越高，基质气化进入色谱柱的可能性越大，因此在满足目标化合物充分气化的前提下，应尽可能选择较低的进样口温度。另外，实验还比较了进样口温度为220 ℃时进样前后微量样品瓶中的油滴情况，结果发现该温度下进样时样品基质基本无挥发。故本实验选择进样温度为220 ℃。

2.2 色谱条件优化

研究发现，样品检测从连续进样的第2个样品开始，总离子流图位的14.5 min处出现一较大的共流出化合物峰，影响目标物定量准确性，并污染仪器。通过对全扫描模式采集的数据及NIST谱库检索结果确认发现其为角鲨烯，这是因为角鲨烯在橄榄油中含量很高[13-14]，且为高沸点物质，易在色谱柱中残留。已有研究表明，柱后反吹技术可降低基质影响，并有效地缩短分析时间[15]，因此实验选择在升温程序结束后，继续升高温度并进行柱后反吹，即在分析结束后提高色谱柱后的氦气压力，并降低进样口的氦气压力，使色谱柱中的氦气反向流动，将残留的高沸点物质从分流出口吹出。结果发现，该方法显著降低了角鲨烯的干扰，优化条件下4种脂肪酸乙酯的加标总离子流图见图1。

2.3 基质效应

基质效应(Matrix effect)指的是样品中除分析物以外的组分对分析结果的干扰，本研究以化合物的空白基质标准曲线斜率与纯物质标准曲线斜率的比值来考察基质效应。结果显示，棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯及硬脂酸乙酯的基质效应系数分别为0.59、0.43、0.47和0.39，4种化合物均表现出明显的基质抑制效应，因此采用空白基质标准曲线进行定量，以降低基质效应的影响。

2.4 线性范围、检出限与定量下限

取空白基质，向其中添加一定量脂肪酸乙酯混合标准溶液，分别配成4种脂肪酸乙酯质量浓度为0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的基质匹配标准溶液，在优化条件下处理并测定。结果显示，在一定质量浓度范围内，4种脂肪酸乙酯与内标的相对含量(x)与对应的相对峰面积(y)呈良好的线性关系，相关系数不低于0.999 6。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得4种脂肪酸乙酯的LOD均为0.3 mg/kg，LOQ均为1.0 mg/kg(表2)，可满足橄榄油中脂肪酸乙酯的检测需求。

表2 4种脂肪酸乙酯的线性范围、线性方程、相关系数、回收率、相对标准偏差(RSD)、检出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,recoveries,relative standard deviations(RSDs),limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of 4 fatty acid ethyl esters

2.5 回收率与重复性

向空白基质中添加1.0、2.0、10 mg/kg的4种脂肪酸乙酯进行加标回收实验，每个添加水平平行6次，在优化条件下处理后测定。结果显示，4种脂肪酸乙酯在低、中、高3个加标浓度下的回收率为82.4%～109%，相对标准偏差(RSD)为0.68%～6.8%(表2)，表明方法的准确度和精密度良好，完全满足实验要求。

2.6 实际样品及质控样品的检测

在优化条件下，对市售特级初榨橄榄油样品(8批次)和质控样品分别采用本方法和SPE/GC-MS法[3]进行测定(表3)。结果显示，本方法与SPE/GC-MS法测定结果无明显差异，两种方法测定同一样品的相对标准偏差均在10%以内；质控样中脂肪酸乙酯的指定值为32 mg/kg，满意范围为20.0～43.0 mg/kg，本方法与SPE/GC-MS方法的检测结果相差不大，且均在质控样给定满意范围内，表明本方法测定结果准确可靠。其中1号橄榄油样品的总离子流图见图2。

表3 不同样品中4种脂肪酸乙酯之和检出情况Table 3 Detection of sum of 4 fatty acid ethyl esters in different samples (mg/kg)

图2 1号橄榄油样品中4种脂肪酸乙酯的总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of 4 fatty acid ethyl esters in sample No.1*.heptadecanoic acid methyl ester,1.palmitic acid ethyl ester, 2.linoleic acid ethyl ester,3.oleic acid ethyl ester, 4.stearic acid ethyl ester

3 总 结

本文采用热分离进样技术，通过优化仪器进样温度，建立了一种无需前处理直接测定橄榄油中4种脂肪酸乙酯的方法。该方法简便快捷，具有灵敏度高，准确度和重现性好等优点。通过对实际样品及质控样品的检测，发现该方法与传统的固相萃取(SPE)结合气质联用(GC-MS)方法检测结果相近，可替代传统方法用于橄榄油中脂肪酸乙酯的快速检测。