超声辅助基质分散液-液微萃取/气相色谱-串联质谱法测定水中48种半挥发性有机物

张 强，崔 君，顾 华，余肖峰，单晓锋，朱 鸽

(1.国土资源部上海资源环境监督检测中心，上海 200072；2.上海市地质勘查技术研究院，上海 200072)

苯胺类(Anilines，ANs)、硝基苯类(Nitrobenzenes，NBs)和邻苯二甲酸酯类(Phthalates，PAEs)化合物常用于制备杀虫剂农药、医药中间体、染料和合成树脂等[1-4]，并能从化工用品或生产废水中迁移到水土环境中[5]，从而污染地表水及地下水。该3类化合物在水中具有极高的稳定性，可在环境中持续存在，且可在生物体内蓄积，对藻类、鱼类和哺乳动物等具有毒害作用，有证据表明其对人体有致癌可能[6-12]。美国环保署(US EPA)规定饮用水中三硝基甲苯的最低限量为2 μg/L，2,4-二硝基苯和2,6-二硝基苯限量均为0.05 μg/L，并将2种苯胺类化合物列入水中129种优先控制污染物名单[13]；欧盟规定玩具和儿童护理用品中PAEs限量为0.1%[14]；我国《地表水环境质量标准》也对地表水中部分硝基苯类和苯胺类化合物的含量作出限定[15]。虽然国内研究者对水中硝基苯、苯胺和邻苯二甲酸酯类化合物分类检测多有研究，但同时测定15种硝基苯、19种苯胺和14种邻苯二甲酸酯类化合物的研究甚少。

目前，水中硝基苯类和苯胺类物质的前处理方法主要为液-液萃取(LLE)[16]、固相萃取(SPE)[17-18]、固相微萃取(SPME)[19-20]、单液滴微萃取(SDME)[21]及顶空微萃取(HSME)[22]等。但液-液萃取耗时长，操作繁琐，溶剂消耗量大；而微萃取则通过减少溶剂体积，提高萃取效率来克服上述问题。本研究充分发挥超声辅助基质分散液-液微萃取(Ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)[24-28]操作简单、快速，富集度高、溶剂损耗少等优点，探究并筛选出同时测定水质中48种常规检测的半挥发性有机污染物的最优条件，并建立了简单、快速和高灵敏度的测定方法，可为后续该类物质痕量水平的检测提供借鉴和参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Trace ISQ单四极杆气相色谱-质谱仪(美国Thermo-Fisher公司)；MinPlus型涡旋混合器(合肥艾本森科学仪器有限公司)；DS-2510DTH型超声波清洗机(上海生析超声仪器有限公司)；Hi-tech KFLOW型超纯水机(上海和泰仪器有限公司)；TDZ4B-WS离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；10 μL进样针(美国Thermo-Fisher公司)。

硝基苯类、苯胺类和邻苯二甲酸酯类混合标准品(2 000 mg/L)；内标标准溶液：1,2-二氯苯-D4(500 mg/L)、菲-D10(200 mg/L)、邻苯二甲酸二辛脂-D4和邻苯二甲酸二丁酯-D4(1 000 mg/L)、苊-D10和萘-D8(1 000 mg/L)均购自上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈和甲醇(HPLC级，德国默克公司)；氯化钠(分析纯)，使用前于400 ℃灼烧4 h；氯苯、四氯化碳、1-十一醇和1-十二醇(优级纯，上海国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为去离子水。

1.2 溶液配制与样品前处理

混合标准工作液：准确移取适量硝基苯类、苯胺类和邻苯二甲酸酯类混合标准溶液用二氯甲烷配成质量浓度为100 mg/L的混合标准工作液。混合内标标准工作液：准确量取适量1,2-二氯苯-D4标准溶液、菲-D10标准溶液、邻苯二甲酸二辛脂-D4和邻苯二甲酸二丁酯-D4混合标准溶液、苊-D10和萘-D8混合标准溶液，用二氯甲烷配成质量浓度为50 mg/L的混合内标标准工作液，于4 ℃避光保存。标准曲线工作液：准确量取适量目标物标准工作液和混合内标标准工作液，用二氯甲烷稀释配成质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的混合标准系列工作液，于4 ℃冰箱中避光保存。

样品采集与保存：地下水取自上海不同地段地下水井，地表水取自上海不同地段河流水，采集后均充满于棕色玻璃瓶，于4 ℃中避光保存。

样品前处理：取10 mL水样于10 mL尖底玻璃离心管中，分别加入2 g/L NaCl、10 μL 1 mg/L混合标准工作液和10 μL 1 mg/L混合内标标准工作液，迅速注入0.65 mL乙腈(分散剂)和40 μL四氯化碳(萃取剂)，轻摇离心管，使其混合至呈均匀的乳化浑浊状，于40 ℃水浴中超声2 min，再将其以3 500 r/min离心3 min，用10 μL进样针在底部抽取1 μL注入GC-MS分析。

空白基质加标：取10 mL不含目标物的水样，按照上述样品前处理方法进行处理。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱：CD-5MS毛细管柱(30 m×2.5 mm×0.25 μm)，程序升温：40 ℃保持1 min，10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。进样口温度260 ℃；载气：氦气(纯度99.999%，液化空气上海有限公司)；流速1 mL/min，不分流模式；电子轰击(EI)离子源；离子源温度：300 ℃；电子能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；进样量：1 μL。扫描模式为选择离子扫描(SIM)。

2 结果与讨论

影响UA-DLLME萃取效率的因素主要有萃取剂和分散剂的类型和体积、萃取时间、萃取温度及离子强度等。为获得最佳实验条件，本研究先采用Plackett-Burman设计筛选实验变量，待确定显著影响因素后，再通过中心复合设计(CCD)和响应曲面法研究各因素间的相互作用关系。

2.1 前处理条件优化

2.1.1 萃取溶剂的选择在UA-DLLME过程中，选择合适的萃取剂至关重要，一般需考虑挥发性低、熔点低、水溶性低且对目标化合物萃取效率高的溶剂。针对本研究所涉及的化合物，可选择烷醇类(1-十一烷醇、1-十二烷醇、2-十二烷醇)、卤代苯类(氯苯、溴苯、氟苯)、氯代烷烃类(CH2Cl2、CCl4、CHCl3)和离子液体4大类溶剂。由于对半挥发性有机物的萃取效率结论不一，且常用的几类离子液体沸点较高，一般用于液相色谱分析。因此，本实验考察了1-十一烷醇、1-十二烷醇、氯苯、CCl44种萃取剂对48种半挥发性有机物的萃取效率。结果显示，1-十一烷醇和1-十二烷醇对邻苯二甲酸酯类化合物萃取效率较高，但对其他2类物质萃取率低；氯苯和CCl4的萃取率相当，但鉴于氯苯的生物毒性较大，故选择CCl4为萃取剂。

2.1.2 分散剂的选择在DLLME过程中，分散剂的加入是一个必不可少的步骤，其用量过少会导致萃取剂在水相中与分析物接触不完全，富集效率低；用量过多又会导致水相的极性降低，使被分析物在水相中的溶解度增大，也会降低富集效率。本研究的几类物质常用的分散剂为甲醇和乙腈，通过实验发现，乙腈的乳化效果最明显，萃取效率最高，因此选择乙腈为分散剂。

2.1.3 萃取剂体积、分散剂体积、萃取温度、萃取时间及离子强度的影响在影响因素较多的情况下，通过Plackett-Burman实验设计，每个因素设置高低2个水平，共12次随机运行的总体设计矩阵，以消除外来或未知变量带来的影响，确定主要影响因素。根据单因子实验选择萃取剂和分散剂后，确定至少有萃取剂体积、分散剂体积、萃取温度、萃取时间和离子强度5个可能的主要影响因素。

由于同类物质的影响趋势相同，因此选择3-硝基苯胺、对-二硝基苯和邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯分别代表苯胺类(NBs)、硝基苯类(ANs)及邻苯二甲酸酯类(PAEs)进行评价(图1)。 Pareto图中的垂直线在判断影响上具有统计意义；超出垂线表明，该因素在95%置信水平下具有显著的统计学影响。结果显示，分散剂体积、萃取剂体积和离子强度为硝基苯类物质的显著影响因素；分散剂体积、萃取剂体积为邻苯二甲酸酯和苯胺类物质的显著影响因素。因此，综合考虑选择萃取剂体积、萃取温度和离子强度为此3类物质的重要影响因素。其中萃取剂体积影响最为显著；增加离子强度能促进分析物进入萃取剂中，提高萃取效率。萃取时间和分散剂体积为非显著影响因素，这是因为UA-DLLME过程中，分散剂起促溶的作用，萃取剂和水相之间有无限大的接触面，萃取能在短时间完成。

图1 目标物的主要因素Pareto图Fig.1 Pareto charts of the main effects for target compoundsA:disperser solvent volumes;B:extraction solvent volumes;C:ionic strength;D:extraction time;E:extraction temperature

基于Plackett-Burman设计筛选结果，将2个非显著因素固定为萃取时间2 min、分散剂体积0.65 mL进行后续实验优化。

2.1.4 中心组合设计-响应曲面法经Plackett-Burman实验设计得到萃取剂体积、萃取温度和离子强度3个显著影响因素，再通过CCD实验进一步验证优化，并通过拟合二阶多项式建立响应模型，公式如下：

式中，x1、x2和x3为3个独立变量，β0为截距，β1～β33为回归系数，y为响应强度。中心复合设计试验次数常用表达式为：2f+2f+C。f为因子数，C为中心点数，本实验因子数为3，中心点数为6，共设计20次实验。

实验结果与二阶多项式方程的拟合值显示出良好的一致性。相关系数R2>0.995，P<0.05，表明该模型显著，精确度满足实验要求。回归模型用于分别计算每个变量的响应面。研究发现，随着萃取剂体积在20～60 μL范围内增加时，目标分析物的响应呈先增加后减小的趋势，在萃取剂体积为40 μL时，响应最大，此时萃取效率最高(图2)；在萃取温度为40 ℃时考察萃取剂体积和离子强度(NaCl浓度)之间的关系，发现当离子强度从0.8 g/L升高到2 g/L时，目标分析物的响应变大，之后随着离子强度升高反而降低(图2A)，因此，设置离子强度为2 g/L；继续考察萃取剂体积和萃取温度间的关系(图2B)，发现目标分析物的响应随萃取温度升高而增加，40 ℃后趋于稳定。

综合考虑上述优化结果，选择40 μL CCl4、0.65 mL乙腈、2 g/L NaCl、萃取温度40 ℃、萃取2 min为最佳萃取条件。

图2 3-硝基苯胺、对-二硝基苯和邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯的响应曲面Fig.2 Response surfaces of 3-nitroaniline,p-dinitrobenzene and DEEPA1,A2 and A3:ionic strength vs extraction solvent volume of 3-nitroaniline,p-dinitrobenzene and DEEP;B1,B2 and B3:extraction temperature vs extraction solvent volume of 3-nitroaniline,p-dinitrobenzene and DEEP

2.2 色谱-质谱条件优化

48种目标物均为弱极性化合物，实验比较了CD-5MS毛细管柱(30 m×2.5 mm×0.25 μm)和CD-1 MS毛细管柱(30 m×2.5 mm×0.25 μm)对目标物的分离效果，结果显示：CD-1 MS色谱柱仅对硝基苯类化合物中少数物质的分离效果较好，而CD-5 MS色谱柱能有效分离此3类物质，因此选择CD-5 MS色谱柱。由于邻苯二甲酸酯类化合物的沸点较高，为缩短死时间，将进样口温度设置为260 ℃；为降低柱后残留和离子源污染，实验将柱温箱最终温度设置为280 ℃，离子源温度设置为300 ℃。在“1.3”所述条件下，48种待目标物混合标准溶液(1.0 mg/L)的总离子流色谱图见图3，48种目标物分离效果好，背景干扰少。

图3 48种目标物的标准GC-MS 总离子流图Fig.3 TIC of GC-MS for 48 target compounds the number 1-48 were the same as those in Table 1

2.3 基质效应、线性关系及富集因子

基质效应(Matrix effect)是指样品中除分析物以外的组分对分析过程产生的干扰，并影响分析结果的准确性，又分为基质增强和基质减弱效应。本研究通过对比同浓度不含待测物的空白水样加入标准物质与纯溶剂(二氯甲烷)配制标准溶液检测信号强度，发现绝大部分目标分析物的基质效应计算值接近1，这是因为，实验所研究的基质为河水和地下井水，较为干净。因此，实验采用二氯甲烷溶剂配制标准溶液绘制标准工作曲线，并计算方法的富集因子(Preconcentration factor，PF)，富集因子为萃取剂中分析物浓度(Csed)与水样中分析物浓度(Co)之比，48种目标化合物的保留时间、选择离子、线性方程、线性范围、相关系数及富集因子见表1。结果显示，48种目标化合物在1～200 μg/L质量浓度范围内的线性良好，相关系数均大于0.995，富集因子为205～371。

表1 48种目标化合物的线性方程、线性范围、相关系数和富集因子Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and preconcentration factors for the 48 target compounds

(续表1)

*quantitative ion

2.4 实际样品分析及加标回收率

取上海不同地区的河水和井水，在优化条件下测定，并向其中添加低、中、高3个浓度的目标化合物进行加标回收实验，每个浓度平行实验6次，计算方法的回收率与相对标准偏差(RSD)，以3倍的空白信号标准偏差与标准曲线斜率的比值计算方法的检出限(MDL)，并以4倍检出限计算定量下限(LOQ)。结果显示，48种目标化合物的MDL为0.001～0.030 μg/L，LOQ为0.004～0.120 μg/L；在3个加标水平下的回收率为77.4%～113%，RSD为2.0%～9.6%(表2)。地下水样品的总流子流图见图4，由此可见，应用Plackett-Burman和CCD实验设计通过DLLME方法所获得的实际样品中目标化合物的准确度和精密度结果令人满意。

表2 48种半挥发性有机物的加标回收率、检出限、定量下限及相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries,MDLs,LOQs and relative standard deviations of 48 semivolatile organic compounds(n=6)

(续表2)

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图4 地下水加标的GC-MS 总离子流图Fig.4 TIC of GC-MS for spiked well water the peak number 1-48 were the same as those in Table 1

3 结 论

本研究建立了超声辅助基质分散液-液微萃取/GC-MS同时测定地表水和地下水中48种半挥发性有机物的分析方法，前处理优化采用Plackett-Burman和CCD实验设计，大大减少了试验次数和溶剂用量。结果表明，48种目标物的LOQ为0.004～0.120 μg/L，回收率为77.4%～113%，RSD不高于9.6%。该方法具有简单、快速等优点，对地表水和地下水中48种半挥发性有机物的痕量分析具有参考意义。