基于多壁碳纳米管/纳米铜复合材料的电化学传感器测定槐米中芦丁

李小蓉，郭 惠，闫 浩，李 治，刘江涛，徐韵怡

(陕西中医药大学 药学院，陕西 西安 712046)

图1 芦丁的结构Fig.1 Structure of rutin

芦丁是一种主要存在于芸香叶、烟草、荞麦、槐树蕾等植物中的黄酮类化合物(结构式如图1)，具有抗炎[1]、抗氧化[2]、清除超氧化物自由基、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等作用，在加强毛细血管弹性、改善人体循环等方面也具有突出效果。因此，含有芦丁的中药材及其制剂在日常生活中的应用越来越广泛，成为人们缓解或治愈病痛的首选。由于中药材的质量易受产地、栽培、采收、贮存、加工等因素而变得良莠不齐，检测中药材及其制剂中的芦丁含量以保证其药用价值就显得尤为重要。因此，建立快速、简便、灵敏度高的芦丁含量的分析方法具有重要意义。目前，芦丁测定的方法主要有高效液相色谱法[3-4]、毛细管电泳法[5]、电化学分析法[6]和荧光分析法[7]等。其中，电化学分析法具有样品前处理简单、响应速度快、检测成本低、选择性好等优点，在中药有效成分的检测方面得到了广泛应用[8-10]。

有关芦丁电化学传感器的研究也取得了一定进展，主要是采用新材料或新方法提高检测灵敏度及方法选择性，所用材料主要有钯[11]、碳纳米管[12]、金[13]、二氧化钛[14]等纳米材料。如张敏等[11]将钯-金复合纳米溶胶滴在玻碳电极(GCE)表面，制作了一种新型芦丁电化学传感器，该传感器对芦丁的电化学氧化具有显著的催化作用，实现了芦丁的电化学检测，检出限为1.0×10-7mol/L。尚永辉等[12]采用多壁碳纳米管(MWNTs)修饰碳糊电极研究了芦丁的电化学行为，对其进行了电化学检测，并在此基础上研究了芦丁与DNA的相互作用。

碳纳米管导电性能优良，对小分子物质具有较好的催化作用，在电化学领域应用广泛[15-16]。大量研究表明，当碳纳米管与其他纳米材料复合时，两者可能存在协同作用，制得的电极材料具有更加优良的性能[17-19]。金属纳米材料在电化学领域应用也较多，常见的有贵金属纳米(Au、Ag、Pt等)材料以及过渡金属纳米(如Cu、Pb、Ni等)材料。而过渡金属Cu由于价格低廉，导电性好，物质扩散极快，在某些方面比贵金属具有更高的氧化电势，呈现潜在的催化优势[20-21]。本研究采用多壁碳纳米管(MWNTs)和纳米铜复合材料修饰玻碳电极构建电化学传感器，建立了一种简单、高灵敏检测芦丁含量的新方法，并应用于中药槐米中芦丁含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；pHS-3C型pH计(上海日岛科学仪器有限公司)；SG8200H型超声波清洗机(上海冠特超声仪器有限公司)；实验采用标准的三电极体系:裸GCE(玻碳电极)(直径3 mm)及不同材料修饰的GCE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。

芦丁对照品(纯度≥98%，北京索莱宝生物科技有限公司)；Nafion(0.5%(体积分数)乙醇溶液，美国Aldrich公司)；MWNTs(99%，中国科学院成都有机化学有限公司)，铁氰化钾、亚铁氰化钾(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；硫酸铜(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；槐米(陕西兴盛德药业有限责任公司)；其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 复合材料修饰电极的构建将GCE在麂皮上用0.5 μm的Al2O3抛光至光亮，用二次蒸馏水洗净，晾干备用。精密称取2.0 mg MWNTs于1 mL 0.5% Nafion溶液中，混合均匀后，室温下于70 kHz超声90 min至溶液透黑均匀且无颗粒，即得2 mg/mL的MWNTs-Nafion分散液。精密移取5 μL分散液，滴涂在打磨好的GCE表面，自然晾干。然后将该电极浸入含0.05 mol/L CuSO4的H2SO4溶液(pH 2.0)中，采用三电极体系，在-0.4 V电沉积8 s，得GCE/MWNTs/Nafion/Cu修饰电极(构建流程见图2)。

图2 修饰电极的制备流程Fig.2 Preparation process of the modified electrode

1.2.2 槐米样品的处理取槐米样品0.1 g，精密称定后置于100 mL烧杯中，加入50 mL甲醇，精密称定质量后用保鲜膜密封，超声处理(250 W，25 kHz) 30 min，将溶液放置冷却，再称重，加入甲醇补足减失的质量，将溶液摇匀，滤过，放于具塞锥形瓶中备用。

1.2.3 传感器的电化学响应测试采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)表征修饰电极的电化学性能。在铁氰化钾溶液中CV法扫描范围为-0.3 ～0.6 V，在芦丁溶液中的扫描范围为0.0 ～0.8 V，扫描速率均为0.1 V/s。当纳米Cu的沉积电位为-0.4 V，沉积时间8 s，缓冲液pH值为3.0以及碳纳米管的使用量为5 μL时，在0.6 ～0.3 V范围内记录差分脉冲伏安(DPV)曲线并读取还原峰电流值，对芦丁进行测定。

2 结果与讨论

2.1 修饰电极表面形态表征

采用扫描电镜(SEM)对修饰电极的形态进行了研究，结果见图3。由GCE/MWNTs/Nafion电极的SEM图(图3A)可见，MWNTs呈细长的管状，结构紧凑，相互交织地分布在GCE表面，使电极具有较大的表面积，其修饰层中含有的元素主要为C、O和F元素(图3C)。电沉积纳米铜后形成GCE/MWNTs/Nafion/Cu电极，其SEM图可见电沉积形成的纳米铜颗粒大小均匀(图3B)，通过Nafion牢固地附着在MWNTs表面，且在电极表面分散性良好，使得电极具有更大的表面积，进一步改善了电极导电性能，其修饰层含有元素Cu(图3D)，表明MWNTs和纳米铜复合材修已成功制备。

图4 铁氰化钾在不同电极上的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of [Fe(CN)6]3- on different electrodes a.GCE,b.GCE/Cu,c.GCE/ MWNTs/Nafion,d.GCE/ MWNTs/Nafion/Cu

2.2 修饰电极的电催化活性研究

分别构建了裸GCE、GCE/Cu、GCE/MWNTs/Nafion、GCE/MWNTs/Nafion/Cu修饰电极，在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)电解液中，采用CV法考察铁氰化钾的电化学行为，以表征不同电极的电催化活性(图4)。结果显示，裸GCE的氧化还原峰电流最小(曲线a)；GCE/Cu电极的氧化还原峰电流较裸GCE略大(曲线b)，表明Cu有催化作用，但效果甚微；GCE/MWNTs/Nafion电极上氧化还原峰电流值明显增加(曲线c)，可见MWNTs比纳米铜具有更高的电催化活性和导电性；而在GCE/MWNTs/Nafion/Cu修饰电极上的氧化还原峰电流最大(曲线d)，其还原峰电流约为裸GCE的8倍，GCE/Cu的6倍，GCE/MWNTs/Nafion的2倍，表明该复合材料修饰电极的电催化活性最高，这可能源于纳米材料间的协同作用所致。

图5 不同修饰电极的电化学阻抗谱Fig.5 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodes a.GCE,b.GCE/Cu,c.GCE/ MWNTs/Nafion,d.GCE/ MWNTs/Nafion/Cu

图6 不同电极对芦丁的循环伏安响应Fig.6 Cyclic voltammograms of different electrodes to rutin a.GCE,b.GCE/Cu,c.GCE/MWNTs/Nafion,d.GCE/ MWNTs/Nafion/Cu

2.3 修饰电极的阻抗表征

EIS可以表征电极的表面特性，进而考察电极在溶液中的电子传递效率，以研究电极修饰材料的导电性能，EIS图中半圆直径越小，表明阻抗越小，即电极在溶液中的电子传输速率越快，电极的导电性能越好。图5为裸GCE、GCE/Cu、GCE/MWNTs/Nafion和GCE/MWNTs/Nafion/Cu 4种电极在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和5.0 mmol/L K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)溶液中的EIS图，由图可知，裸GCE的阻抗最大(曲线a)，GCE/Cu修饰电极的阻抗稍小(曲线b)，主要是由于纳米铜具有较大的比表面积，改善了GCE的导电性；与GCE/Cu电极相比较，GCE/MWNTs/Nafion电极的阻抗大幅减小(曲线c)，表明MWNTs比纳米铜的导电性能更好，而GCE/MWNTs/Nafion/Cu电极的阻抗图几乎是一条直线(曲线d)，表明其电子传输速率最快，导电性能最优，可能是由于复合纳米材料之间存在协同作用，极大地改善了其电化学性能，与循环伏安研究结果一致。

2.4 芦丁在不同电极上的电化学响应

实验研究了1.0×10-5mol/L芦丁在裸GCE、GCE/Cu、GCE/MWNTs/Nafion和GCE/MWNTs/Nafion/Cu电极表面的电化学响应(图6)。由图可见，芦丁在裸GCE表面于0.45 V左右出现一对氧化还原峰(曲线a)，但峰电流值最小，表明其对芦丁的响应最差；在GCE/Cu电极表面(曲线b)，氧化峰电流(Ipa)和还原峰电流(Ipc)略有增加，但增幅较小，表明纳米铜对芦丁的催化作用较弱；GCE/MWNTs/Nafion电极的峰电流值明显增加(曲线c)，表明MWNTs对芦丁较好的催化作用；而在GCE/MWNTs/Nafion/Cu电极上(曲线d)，峰电流值显著增加，其还原峰电流值约为GCE/MWNTs/Nafion电极的5倍，表明MWNTs和纳米铜复合后，显著增加了电极的比表面积，电极表面的活性位点进一步增加，二者协同催化芦丁在电极上的电化学反应。

2.5 实验条件优化

2.5.1 缓冲液pH值的选择以GCE/MWNTs/Nafion/Cu为工作电极，0.1 mol/L PBS缓冲溶液为介质，采用CV法考察了不同缓冲溶液pH值对1.0×10-5mol/L芦丁在电极表面的电化学响应。结果显示，当缓冲溶液pH值从2.0增至3.0时，芦丁的还原峰电流值逐渐增加，且在pH 3.0时达到最大值，继续增加缓冲溶液pH值，还原峰电流值反而逐渐减小。因此，选择PBS缓冲溶液的最佳pH值为3.0。另外，随着缓冲溶液pH值的增加，体系还原峰电位(Epc)发生负移，两者关系符合方程Epc=0.589-0.053 pH(r=0.997)，说明电极反应过程中有H+参与，再根据公式Epc=E0-0.059(m/n)pH[22]计算得m=n，表明芦丁在该电极表面是一个等电子等质子的反应过程。

2.5.2 扫描速率的选择为进一步了解芦丁在GCE/MWNTs/Nafion/Cu电极上的反应机理，以PBS缓冲液(pH 3.0)为介质，考察了1.0×10-5mol/L芦丁在不同扫速(50、100、150、200、250、300、350 mV/s)下的循环伏安图。结果显示，芦丁的氧化峰及还原峰电流均随扫速的增加而逐渐增加，其中氧化峰电位逐渐正移，还原峰电位逐渐负移，即峰电位差逐渐增大，表明芦丁在电极表面反应的可逆性逐渐变差。综合考虑峰形和峰电流，选择0.1 V/s为CV的最佳扫描速率。通过进一步数据分析发现，在50 ～350 mV/s范围内，芦丁的还原峰电流(Ipc)与扫描速率的平方根及扫描速度(v,mV/s)成正比，其线性方程分别为Ipc=8.27v1/2-39.76(r=0.997)和Ipc=0.32v+9.48(r=0.998)，表明芦丁在该修饰电极上的还原过程是受扩散和吸附共同控制的电极过程。

2.5.3 沉积电位的选择由于不同的沉积电位影响纳米铜在电极表面的形态及大小，进而影响修饰电极对芦丁的响应，因此对纳米铜的沉积电位(-0.25 ～-0.5 V)进行了考察。结果显示，随着沉积电位的降低，芦丁的还原峰电流不断增加，在-0.4 V时达到最大；之后继续降低沉积电位，还原峰电流反而减小，故选择-0.4 V为纳米Cu的最优沉积电位。

2.5.4 沉积时间的选择纳米铜沉积时间影响其在电极表面的厚度，进而影响电极的导电性及电子传递速度，从而对芦丁的电化学信号产生影响，因此，实验考察了不同沉积时间(4、6、8、10、12 s)下的传感器对芦丁的响应。结果显示，当沉积时间由4 s增加到8 s时，芦丁的还原峰电流值逐渐增加，且在8 s时达到最大，继续增加沉积时间，还原峰电流值反而降低，表明纳米铜的厚度偏大，导致修饰电极对芦丁的响应变差。因此，实验选择纳米Cu最佳沉积时间为8 s。

2.5.5 碳纳米管用量的选择MWNTs具有良好的导电性和较大的表面积，在一定用量范围内可以极大地提高修饰电极对芦丁的响应，但若用量过多，会导致修饰电极的厚度增大，反而降低电子传递速率，不利于分析测定，因此，实验考察了MWNTs用量(2、3、5、7、9 μL)对芦丁的电化学响应。结果显示，当MWNTs用量为5 μL时，电流值达到最大；继续增加MWNTs的用量会使还原峰电流值降低，表明此时修饰涂层太厚，阻碍了电子的传递，降低了电极的灵敏度。因此实验选择MWNTs用量为5 μL。

2.6 芦丁的测定

在优化条件下制备GCE/MWNTs/Nafion/Cu修饰电极，采用DPV法对不同浓度(1.0×10-8、3.0×10-8、5.0×10-8、7.0×10-8、1.0×10-7、5.0×10-7、7.0×10-7、1.0×10-6mol/L)的芦丁标准溶液进行测定，记录其DPV曲线(图7A)。由图可见，在1.0×10-8～1.0×10-6mol/L浓度范围内，还原峰电流(Ipc，μA)随芦丁浓度(c，μmol/L)增大而增大，其线性方程为Ipc=11.0c+6.38(r=0.998)(图7B)，检出限(S/N=3)为8.4×10-9mol/L。与已报道的芦丁传感器相比较，具有较宽的线性范围和较高的灵敏度(表1)。这种响应不仅是MWNTs和纳米铜的简单叠加，而主要源于颗粒均匀、性能优良的纳米铜与MWNTs之间具有良好的协同增效作用，改善了电极表面性能，加快了电子转移速率，从而提高了传感器的灵敏度。

SensorLinear range(10-7 mol/L)Detection limit(10-7 mol/L)ReferenceGCE/Pd-Au25 ～7501.0[11]CPE/MWCNTs5.0 ～2 0002.0[12]GCE/MWNTs-CHIT/Au4.00 ～1771.29[13]GCE/Au-TiO2-Nafion1 ～1000.83[14]GCE/Poly(Congo red)0.5 ～800.2[23]GCE/MWNTs/Nafion/Cu0.1 ～100.084This work

2.7 电极的重现性、稳定性及选择性

电极重现性及稳定性对测量结果具有重要影响，将制备的复合材料修饰电极置于PBS缓冲液(pH 6.0)中，用CV法在-0.8 ～0.8 V电位范围内扫描10圈活化，再用DPV法对1.0×10-7mol/L芦丁重复测定6次，得相对标准偏差(RSD)为2.8%。采用相同方法分别制备3支修饰电极，测定芦丁(1.0×10-7mol/L)的RSD为2.3%。将电极于室温下放置15 d，在相同条件测定，发现芦丁(1.0×10-7mol/L)，还原峰电流仍能达到最初的96%，表明所制备的修饰电极有良好的重现性和稳定性。

由于在实际应用中，样品测定常会被未知物质干扰，进而影响测定结果，因此对传感器的选择性进行了考察。结果显示，当电流测量误差小于5%时，150倍的硝酸根离子、锌离子、硫酸根离子、钙离子、镁离子等无机离子，100倍的多巴胺(DA)、葡萄糖(C6H12O6)、尿酸(UA)等对芦丁的测定几乎无干扰。表明该传感器抗干扰能力较强，选择性较好。

2.8 实际样品测定

取“1.2.2”制备的样品溶液10 μL，将其稀释10 000倍，精密移取10 mL，用DPV法测定芦丁含量，平行实验3次，并与药典的HPLC法进行对比。结果显示，采用HPLC法测定的芦丁含量为23.06%，采用本法测定的芦丁含量为23.28%，表明所制备的修饰电极测定结果符合2015版药典规定的“按干燥品计算，槐米含无水芦丁(C27H30O16)不得少于15.0%”。再向其中分别加入4.0×10-7、6.0×10-7、8.0×10-7mol/L的芦丁标准溶液，采用DPV法平行测定3次，得其回收率为98.1% ～101%。表明本方法可用于实际样品中芦丁含量的测定，具有较高的准确度。

3 结 论

本文将多壁碳纳米管-Nafion滴涂在玻碳电极表面，然后电沉积纳米铜，构建了一种新型芦丁电化学传感器。该传感器不仅具有MWNTs和纳米铜各自的特点，并且两者复合后产生的协同作用使电极的比表面积更大，电子转移能力更强，因此芦丁在其表面的电化学活性显著提高。在优化实验条件下，该传感器对芦丁的线性范围为1.0×10-8～1.0×10-6mol/L，检出限为8.4×10-9mol/L。将其用于槐米中芦丁含量的测定，回收率为98.1% ～101%，表明该传感器对芦丁的检测具有灵敏度较高、线性范围较宽、检出限较低等优点，在检测中药中芦丁含量方面具有发展及应用空间，为芦丁相关药物的质量监控提供了新平台。