钩吻总碱抑制人结肠癌细胞增殖及血管新生的作用研究

王文义 檀兴慧 张萍萍 杨宇珂 黄梓泓 李德森 吴水生

摘 要 目的：探讨钩吻总碱（TAG）抑制人结肠癌细胞增殖及血管新生的作用。方法：体外培养人结肠癌细胞HT-29和人脐静脉内皮细胞（HUVEC），经低、中、高剂量TAG（40、80、120 μg/mL）干预后，使用倒置荧光显微镜观察两种细胞的形态，采用CCK-8法检测两种细胞的存活率，采用流式细胞术检测HT-29细胞的周期变化情况，采用划痕试验、Transwell侵袭试验和管腔形成试验检测HUVEC的迁移率、侵袭率和管腔数量。结果：与空白组比较，TAG各剂量组HT-29细胞和HUVEC均有不同程度的减少，并可见死亡细胞，两者存活率均显著降低（P<0.05或P<0.01）;TAG各剂量组G2/M期HT-29细胞比例以及中剂量组G0/G1期细胞比例均显著升高，而TAG各剂量组S期细胞比例以及高剂量组G0/G1期细胞比例均显著降低（P<0.05或P<0.01）;TAG各剂量组HUVEC的存活率、迁移率、侵袭率均显著降低，4～24 h各时间点管腔数量均显著减少（P<0.01）。结论：TAG可抑制人结肠癌HT-29细胞和HUVEC的增殖，可改变HT-29细胞的周期，并抑制HUVEC的迁移、侵袭及管腔形成。

关键词 钩吻总碱;结肠癌;HT-29细胞;人脐静脉内皮细胞;增殖;迁移;侵袭;血管新生

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the inhibitory effects of total alkaloids of Gelsemium elegans （TAG） on the proliferation and angiogenesis of human colon cancer cells. METHODS： Human colon cancer cell line HT-29 and HUVEC were cultured in vitro. After the intervention of low-， medium-， high-dose TAG （40， 80， 120 μg/mL）， the morphology of the two cells was observed by fluorescence inversion microscope. The survival rate of HT-29 cells and HUVEC was detected by CCK-8 assay. Flow cytometry was used to detect HT-29 cell cycle. The migration rate， invasion rate and tube number of HUVEC were observed by scratching test， Transwell invasion experiment and tube formation experiment. RESULTS： Compared with blank group， HT-29 cells and HUVEC were decreased to different extents in TAG groups; dead cells were observed， and the survival rate of both decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The proportion of HT-29 cells at G2/M phase in TAG groups as well as those at G0/G1 phase in medium-dose group were increased significantly; the proportion of HT-29 cells at S phase in TAG groups as well as those at G0/G1 phase in high-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Survival rate， migration rate and invasion rate of HUVEC were decreased significantly in TAG groups， and tube number was also decreased significantly at each time point during 4-24 h （P<0.01）. CONCLUSIONS： TAG have inhibitory effect on the proliferation of human colon cancer HT-29 cells and HUVEC， can change HT-29 cell cycle， inhibit the migration， invasion and tube formation of HUVEC.

KEYWORDS   Total alkaloid of Gelsemium elegans; Colon cancer; HT-29 cells; HUVEC; Proliferation; Migration; Invasion; Angiogenesis

結肠癌（Colon cancer，CRC）是常见的胃肠道恶性肿瘤，2018年全球CRC患者病死率和发病率分别位列恶性肿瘤的第2、3位[1]，且目前仍无有效防治CRC的措施。中药防治CRC具有低毒、有效的特点，有一定的开发价值[2-4]。钩吻[Gelsemium elegans（Gardn. et Champ.）Benth.]为马钱科胡蔓藤属植物，又名断肠草、大茶药、野葛以及胡蔓藤等，其具有良好的抗肿瘤、镇静、镇痛、调节免疫功能等多种药理活性，在肿瘤患者镇痛和肝癌患者生存期延长等方面具有独特的优势[5-7]。钩吻总碱（TAG）是钩吻的主要成分之一，其既为活性成分，也是毒性成分。本课题组前期研究表明，TAG能抑制CRC细胞的增殖，并可抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖与迁移，但具体作用及其机制尚不明确[8-10]。有研究指出，肿瘤细胞的存活与增殖依赖于血管生成[11]，而钩吻及其活性成分能否影响CRC细胞的血管生成、且通过何种形式调控这一个过程，尚未见相关研究报道。鉴于钩吻对CRC细胞的抑制活性，本研究初步探讨了TAG在CRC血管生成中的作用及可能机制，旨在为钩吻及其活性成分在CRC临床治疗中的应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

HF212 UV型CO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）;Multiskan FC型酶标仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司];FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）;IX70型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）;TDZ4A-WS型低速水平离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 药品与试剂

钩吻药材购自福建省龙岩市胡蔓藤种植基地，经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为钩吻真品。TAG冻干粉由福建中医药大学药学院中药药效物质基础实验室制备（得率为0.6%）。

0.25%胰蛋白酶（批号：2048080）、胎牛血清（FBS，批号：1982158C）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，批号：8119049）、RPMI 1640培养基（批号：8119022）、青链霉素（批号：2019313）均购自美国Gibco公司;McCoys 5A培养基（江苏凯基生物技术有限公司，批号：20190212）;CCK-8试剂盒（美国MCE公司，批号：30116）;碘化丙啶/核糖核酸酶（PI/RNase）染料（美国BD公司，批号：9039585）;Triton X-100试剂[爱必信（上海）生物科技有限公司，批号：J02N];结晶紫试剂（批号：1130P041）、Matrigel基质胶（批号：20190218）均购自北京索莱宝科技有限公司;二甲基亚砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）等试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 细胞

人CRC HT-29细胞、HUVEC均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

2 方法

2.1 药液配制

取TAG冻干粉100 mg，溶于DMSO 4 mL中，配成质量浓度为25 mg/mL的TAG母液，于4 ℃保存，备用。临用前用McCoys 5A完全培养基或RPMI 1640完全培养基（即含有10%FBS、1%青链霉素的McCoys 5A培养基或RPMI 1640培养基）稀释至相应质量浓度。

2.2 细胞培养

将HT-29细胞和HUVEC分别接种至含McCoys 5A完全培养基和RPMI 1640完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2条件下培养（培养条件下同）。

2.3 细胞形态观察

使用倒置荧光显微镜观察。取对数生长期的HT-29细胞、HUVEC各适量，经含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1.0×105个/mL按每孔2 mL接种至6孔板中，培养，待细胞融合至50%～60%后，将其随机分为空白组和TAG低、中、高剂量组[40、80、120 μg/mL，剂量参考已有文献和TAG半数抑制浓度（IC50）[8，10]设置，下同]，每组设3个复孔。弃去培养基，空白组加入相应完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基2 mL。培养24 h后，于倒置荧光显微镜下观察并拍摄细胞形态。

2.4 细胞活力检测

采用CCK-8法检测。取对数生长期的HT-29细胞、HUVEC各适量，经含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1.0×105个/mL按每孔100 μL接种至96孔板中，培养，待细胞融合至50%～60%后，将其随机分为空白组、DMSO组和TAG低、中、高剂量组（40、80、120 μg/mL），每组设6个复孔。弃去培养基，空白组加入相应完全培养基100 μL，DMSO组加入含DMSO 0.5 μL的完全培养基100 μL，各给药组加入含相应药物的完全培养基100 μL。培养24 h后，加入CCK-8试剂10 μL，避光培养4 h，使用酶標仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算细胞存活率：存活率=（空白组平均OD值-试验组平均OD值）/空白组平均OD值×100%。上述试验重复3次。

2.5 HT-29细胞周期变化检测

采用流式细胞术检测。取对数生长期的HT-29细胞适量，经不含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1.0×105个/mL按每孔2 mL接种至6孔板中，培养，待细胞融合至50%～60%后，将其随机分为空白组和TAG低、中、高剂量组（40、80、120 μg/mL），每组设3个复孔。弃去培养基，空白组加入McCoys 5A完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的McCoys 5A完全培养基2 mL。培养24 h后，吸弃上清液，收集细胞，用4 ℃ PBS清洗后，置于70%乙醇中，于-20 ℃固定过夜，以1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用PBS清洗后，加入含0.2%Triton X-100试剂的PI/RNase染料0.5 mL，避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布情况并使用Modfit 5.0周期拟合软件进行分析。上述试验重复3次。

2.6 HUVEC迁移能力检测

采用划痕试验检测。取对数生长期的HUVEC适量，经含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1×105个/mL按每孔2 mL接种至6孔板中，培养，待细胞铺满后，用200 μL枪头在每孔底部中央作一划痕，用PBS清洗后，将细胞随机分为空白组和TAG低、中、高剂量组（40、80、120 μg/mL），每组设3个复孔。弃去培养基，空白组加入RPMI 1640完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的RPMI 1640完全培养基2 mL。分别于培养的0、24 h时拍照，并使用Image Pro-Plus 6.0软件分析结果，计算迁移率：迁移率=（0 h时迁移距离-24 h时迁移距离）/0 h时迁移距离×100%。上述试验重复3次。

2.7 HUVEC侵袭能力检测

采用Transwell侵袭试验检测。取对数生长期的HUVEC适量，经含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1×105个/mL按每孔2 mL接种至6孔板中，将其随机分为空白组和TAG低、中、高剂量组（40、80、120 μg/mL），每组设3个复孔。弃去培养基，空白组于小室上层加入RPMI 1640完全培养基200 μL，各给药组于小室上层加入含相应药物的RPMI 1640完全培养基200 μL，各组均于小室下层加入RPMI 1640完全培养基700 μL。培养24 h，弃去上清液，用棉签擦拭上层底部未穿膜的细胞，用PBS清洗，以多聚甲醛溶液固定20 min后，加结晶紫试剂染色15 min，用PBS清洗，使用倒置荧光显微镜观察，每孔随机选择5个视野，拍照并记录染色细胞（染色后呈紫红色的细胞即为发生迁移的细胞）数，同时计算侵袭率：侵袭率=试验组迁移细胞数/空白组迁移细胞数×100%。上述试验重复3次。