CRISPR/Cas9技术在观赏植物改良育种上的应用研究进展

谢园园

摘要    CRISPR/Cas9技术是继ZFN、TALEN后目前新兴的基因定点改造技术手段。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展演化及优势，总结了其在观赏植物上的应用现状及巨大潜力。目前，该技术已成功应用于百脉根、毛白杨、铁皮石斛、苜蓿、矮牵牛、日本牵牛花、菊花、兰猪耳、菊苣等观赏植物上，为在观赏园艺上的性状改良、基因工程研究提供了有力依据和手段。

关键词    CRISPR/Cas9;观赏植物;育种改良;基因编辑

中图分类号    S722.5        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）08-0134-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

基因突变是促进物种进化的有效途径，传统的自然突变、物理和化学诱变、T-DNA随机插入以及转座子等方式无定向性且周期较长[1]。基因编辑技术能利用植物的基因组库精确改变DNA序列，缩短育种周期，尤其是新兴的成簇规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short Palindromic repeats，CRISPR）技术，在生物、医学及植物领域有着巨大的应用潜力。如今随着社会经济的发展和生活水平的提高，观赏植物在城市发展、室内外绿化中的应用愈加广泛，花色丰富、花型奇特和抗性强的优良观赏植物产业需求不断增加。因此，运用CRISPR/Cas9技术对观赏植物进行育种改良具有重要意义。

1    基因编辑技术的发展及演化

基因编辑技术至今一共经历了3代的发展。第1代是锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs），第2代是类转录激活因子效应核酸酶（transcription activator-like effector nu-clease，TALEN）。ZFNs和TALEN原理相似，均携带了能产生双链断裂的催化结构域的限制性核酸内切酶FokⅠ，但二者结构复杂、操作困难且成本高昂，应用受限[2-3]。1987年，Ishino等[4]发现大肠杆菌中存在29个核苷酸重复序列，这些重复序列被一些非重复的短序列间隔开。2000年，Jansen等[5]首次将这种大多数原核生物中均存在的规律成簇的间隔短回文重复序列命名为“CRISPR”。CRISPR及其相关蛋白（CR-ISPR-associated protein），尤其是Cas9，源自细菌和古细菌[6]，是原核生物适应性免疫系统，它保护原核生物免受病毒等入侵DNA的侵害，精准、快速、灵活性好，同时体量小，可用于基因敲除、调节内源基因的表达、单链RNA编辑、染色体位点活细胞标记和高通量基因筛选[7]。该技术的出现，成为现阶段最受欢迎的第3代基因编辑技术并一直运用在生物学各领域。

2    CRISPR/Cas9技术原理和相关优势

2.1    技術原理

CRISPR/Cas9系统包含一个非特异性可切割双链DNA的Cas9蛋白和一个控制靶点特异性的向导RNA（small guide RNA，sgRNA），sgRNA将Cas9引至特定的基因组位置，引导Cas9切割目标基因双链DNA从而形成双链断裂（DNA dou-ble strand break，DSBs），其中目标基因的3′端是PAM序列（protospacer-adjacent motif，PAM），其下游具有NGG序列才能被Cas9结合、切割[8]。随后，DSBs触发非同源末端连接（no-nhomologous end joining，NHEJ）或同源重组（homologous rec-ombination，HR）的细胞DNA修复途径，产生插入或缺失突变[9-10]。根据不同的修复途径，DSBs实现对不同位点特异性的DNA序列的修复[11]。其中，NHEJ的修复主要是在编码区引起插入或删除突变，导致基因敲除;而HR的修复则需在与 DSBs序列具有同源DNA模板的基础上，实现同源DNA序列的定点替换或插入[12]。

2.2    CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑领域的优势

普通的转基因植物需整合外源基因进入植物基因组中以产生所需的性状，而通过CRISPR/Cas9编辑的植物不需引入外源基因即可获得纯合的突变体，且与常规育种方法获得的突变体植物一样具有稳定的遗传能力，减少了普通转基因带来的伦理争议[13]。Zhang等[14]在2016年就通过CR-ISPR/Cas9 DNA或RNA的瞬时表达在六倍体普通小麦和四倍体杜兰小麦中进行愈伤组织再生获得不含转基因的纯合突变体植株，有效刺激了植物更深入的基因工程研究。

植物性状的表达既可能是单基因，也可能是多基因控制。传统的育种方法进行性状改良耗时长且效率不高，而利用CRISPR/Cas9技术可以更高效地获得植物基因组中的多个基因突变。不同于常规育种，CRISPR/Cas9系统中多个sg-RNA可以同时表达[15-16]，且在目标序列中产生的特定突变是定向和可控的，这极大地降低了成本和形成多个靶点突变的植物所需的时间。因此，培育性状理想和优良品种植株的效率要远远高于常规突变育种。

3    CRISPR/Cas9基因编辑技术在观赏植物上的应用

目前，在基因编辑上进行应用的观赏植物较少，主要有百脉根、毛白杨、铁皮石斛、苜蓿、矮牵牛、大牵牛花、菊花、兰猪耳、菊苣等。

3.1    百脉根

百脉根（Lotus japonicus）是一种典型的豆科百脉根属牧草，具有一定的观赏价值。通过农杆菌介导的遗传转化，CR-ISPR/Cas9系统可有效诱导百脉根共生固氮（symbiotic nitro-gen fixation，SNF）相关基因突变。通过设计LjU6-1启动子驱动的靶向SYMRK基因位点的sgRNA，在20株T0代转基因植物中实现了约35%的诱变效率;此外，设计了2个靶向3 个同源豆血红蛋白基因位点（LjLb1，LjLb2，LjLb3）的 sgRNA，获得20株出现白色结节且每株至少有2个LjLbs基因被破坏的毛根转化结瘤表型，同时通过sgRNA的稳定转化实现LjLbs的三倍突变体敲除，验证了CRISPR/Cas9技术在观赏植物上基因敲除的可能性[17]。

3.2    毛白杨

毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是一种常见的杨柳科柳属园林树木。2015年，Fan等[18]以毛白杨PtoPDS基因的不同位点为靶标设计4种sgRNA，通过农杆菌介导转化，在转化的植株中观察到显著的白化病表型，突变效率约 51.7%，且白化病植株的PDS基因中均含有突变等位基因，且4种sgRNA对Cas9的定向和靶基因的突变产生的贡献不等，证实了正确选择sgRNA对有效产生缺失突变至关重要;此外，对毛白杨基因进行扩增时发现，Cas9能指导单个转基因植物中2个拷贝基因上的突变，这表明Cas9/sgRNA系统具有一次敲除杨树基因组中2个或多个基因位点的能力。该研究为CRISPR/Cas9技术在木本植物上的应用提供了首例模板。

3.3    铁皮石斛

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属的一种兼具药用价值和观赏价值的植物。Yan等[19]在2015年完成铁皮石斛的基因组草图，为铁皮石斛今后的基因编辑工作奠定了基础。其后在2017年Ling Kui等[20]利用农杆菌介导的CRISPR/Cas9基因转化系统，将包含CaMV35S启动子、β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）以及绿色荧光蛋白的pCambia-1301-35SN载体作为报告基因导入铁皮石斛植物组织，成功转录并翻译成功能蛋白。同时，选择5个基因C3H、C4H、4CL、CCR和IRX为靶基因，并对靶基因位点进行PCR扩增，获得突变率在10%～100%之间的试验结果。该项研究是运用CRISPR/Cas9技术进行植物基因编辑的成功案例，该高效的研究工具不仅有助于育成新的铁皮石斛品种，而且对兰花生物学的分子遗传学研究也有重要的参考价值。

3.4    苜蓿

苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿属的一种模式植物，也是世界上最重要的牧草作物之一，同时还可食用及作观赏绿化用，用途较为广泛。2016年，Meng等[21]克隆了苜蓿 U6启动子来驱动特定sgRNA的表达，并以pFGC5941为骨架，构建了双载体pFGC5941-Cas9，通过农杆菌介导的转化，将含有Cas9和特定pMtU6：：gRNA表达片段的目的结构体引入到蒺藜苜蓿生态型R108中，在T0代中成功获得10.35%的MtPDS纯合突变体。这项研究为加快豆科观赏植物性状改良提供了有力的理论依据。

3.5    矮牵牛

矮牵牛（Petunia hybrid）是茄科碧冬茄属一种重要观赏植物。2016年，Zhang等[22]利用CRISPR/Cas9系统对矮牵牛基因组进行靶向诱变，以PDS为靶基因，获得55.6%～87.5%突变率的白化表型。最近，又有研究人员分析矮牵牛不同花发育階段PhACO基因PhACO1、PhACO3和PhACO4与花乙烯产量的关系，检测发现3种基因表达量逐步升高，与花朵中乙烯含量的升高趋势吻合，且ACO1表达量远远高于其他2种同源基因。其后利用CRISPR/Cas9系统敲除PhACO1基因，获得的T0代突变体株系，与野生型相比均存在乙烯产量显著降低且花寿命延长的性状，其中纯合突变体中的花寿命延长和乙烯产量的降低要强于单等位基因突变体[23]。

3.6    日本牵牛花

CRISPR/Cas9系统作为有效的基因功能研究工具能定向改良花卉品质，延长花的寿命。2017年，日本学者先后发表了2篇关于CRISPR/Cas9技术成功改良日本牵牛花花色的研究，为自然界中其他花卉花色改良育种提供了思路。日本牵牛花（Ipomoea （Pharbitis） nil）在日本是一种传统的园林观赏植物，为旋花科牵牛属，花色丰富，但由于花瓣中类胡萝卜素含量极少以致没有黄色品种。科学家们通过分析牵牛花的花瓣花色形成机理，发现类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）可裂解类胡萝卜素多烯链的特定双键，从而可能影响类胡萝卜素在花瓣中的积累。因此，研究中利用CRISPR/Cas9技术敲除白色牵牛花 AK77品种中的InCCD4基因，获得黄色花瓣的AK77突变品种。与正常非转基因植株相比，CCD4突变植株中类胡萝卜素的含量增加了20倍[24-25]。

3.7    菊花

菊花（Chrysanthemum morifolium）是菊科菊属植物，世界四大切花之一，具有极高的观赏价值和经济价值。菊花属于异源多倍体植物，染色体高度杂合缺乏完整的基因组信息，导致很难将突变引入[26]。2017年，Mitsuko Kishi-Kaboshi等人运用 CRISPR/Cas9技术编辑菊花的绿色荧光蛋白（CpYGFP）基因，通过靶向CpYGFP基因的不同位点，最终得到CpYG-FP序列突变的菊花突变体[27];之后李 翠等[28]以菊花品种“神马”为试验材料，构建以菊花赤霉素合成关键酶GA20氧化酶基因DgGA20ox为目标基因的载体，采用农杆菌介导法，成功获得DgGA20ox基因移码突变的菊花转基因植株，有效沉默菊花DgGA20ox基因。这些研究为以后菊科植物应用基因编辑技术以及基因工程研究奠定了一定的基础。

3.8    蘭猪耳

兰猪耳（Torenia fournieri L.）是玄参科蝴蝶草属一种兼具观赏价值和药用价值的夏季草花。2018年，研究者们通过CRISPR/Cas9系统诱导模式植物兰猪耳中黄酮醇e3-羟化酶（F3H）基因突变，获得约80%的株系花色发生变化的T0代，且12个转基因株系中有10个开出淡蓝色花的稳定表型。而后来通过序列分析发现，转基因株系的F3H靶序列发生了碱基置换、插入或缺失等突变，从而表明这些稳定表型是通过内源性F3H基因的靶向诱变诱导获得的[29]。因此，该研究也证实基因编辑可有效实现花色改良，对于花色素以及其他基因功能研究具有重要意义。

3.9    菊苣

菊苣（Cichorium intybus L.）是一种可食用、观赏的菊科菊苣属药用植物[30-31]，很多地方都因其巨大的经济价值对其进行大规模种植。为获得产量更高和营养价值更丰富的新品种，科研工作者们对转基因菊苣产生兴趣，并由此将CRIS-PR/Cas9技术成功应用于菊苣上。Guillaume Bernard等[32]分别运用根癌农杆菌介导转化和原生质体转染法，以AU6启动子驱动sgRNA，构建诱导菊苣八氢番茄红素脱氢酶基因（chicory phytoene desaturase，CiPDS）的第5个外显子定向突变的二元载体，最终在所有突变植株中检测到双等位基因突变，且根癌农杆菌介导转化法以31.25%的突变率优于突变率为4.5%的原生质体转染法。该项研究表明，我们使用CRISPR/Cas9技术可以成功地进行遗传改良和生物功能学研究。

4    目前CRISPR/Cas9技术在观赏植物应用上的阻碍

4.1    种类繁多，缺乏有效完整的基因组信息

基因编辑是基于DSBs进行修复的，物种和细胞类型不同时，DSBs修复途径的效率也存在一定差异[33-34]，那么对于不同基因类型的观赏植物的不同遗传性状的改良，皆需进行针对性的定向修饰，而这种利用CRISPR/Cas9技术进行的编辑必须以已知完整的基因组信息为基础。但与品种相对单一的农作物相比，一方面观赏植物的经济重要性相对较小，导致对其的基因组序列研究和关注度较少;另一方面观赏植物商业品种繁多，其中很多观赏植物属于多倍体物种，染色体结构复杂，基因组序列信息不全，未建立有效的遗传转化体系。因此，为其开发合适的表达系统和靶序列构型有一定的困难，这些都极大地阻碍了此技术在观赏植物上的发展。

4.2    CRISPR-Cas9系统自身的脱靶效应

sgRNA的识别序列决定CRISPR/Cas9系统的特异性，但CRISPR-Cas9系统也可能切割与靶点DNA类似，但有不同碱基的DNA序列，造成与非目标DNA序列错配，从而导致预期之外的基因突变[35]。2013年，Fu等[36]即发现RNA引导的核酸内切酶可以在3种不同类型的人类细胞中引起显著的脱靶诱变。2018年，Zhang等[37]又通过研究CRISPR/Cas9在拟南芥上的脱靶效应，发现子代拟南芥突变体中产生更显著的脱靶效应。这种脱靶效应会极大地影响基因编辑效率，但稳定的转化是引入突变最有效的途径。因此，如何提高转化率，将基因编辑片段成功引入目标组织仍是一个挑战。

5    展望

观赏植物是人类生活不可或缺的一部分，具有重要的观赏及食用、药用价值等。CRISPR/Cas9技术作为功能基因组学研究和植物生物技术的重要工具，它的问世和发展对植物基因工程领域产生了巨大的影响。目前，该技术在农作物上有较多应用，在观赏植物上应用较少，但运用这一技术可有效改良观赏植物性状，提高抗性，延长货架期，增加美学价值。与传统育种相比，CRISPR/Cas9技术能有效快速改良植物性状，直接对植物的内源基因进行定向修饰，不会引入外源基因，比普通转基因更安全，减少了转基因带来的伦理问题。但脱靶效应等问题也限制和困扰着育种者们。为此，近年来又有一些新的编辑技术如CRISPR/Cas12a问世，有研究[38]认为，该基因编辑系统在多个物种的编辑过程中相比CRISPR/Cas9脱靶率更低，但因其编辑范围较窄，所以目前在植物上的应用较少，但其为编辑技术突破阻碍带来希望。相信通过不断的技术进步和条件优化，以及观赏植物完整基因序列的发掘，在未来不断完善的基因编辑系统可以在观赏植物育种改良上发挥更深远的作用和现实意义。

6    参考文献

[1] ZHANG Y，MA X，XIE X，et al.CRISPR/Cas9-based genome editing in plants[J].Progress in Molecular Biology and Translational Science，2017，149：133.

[2] GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F.ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].Trends in Biotechnology，2013，31（7）：397-405.

[3] RANI R，YADAV P，BARBADIKAR K M，et al.CRISPR/Cas9：a promis-ing way to exploitgenetic variation in plants[J].Biotechnology Letters，2016，38（12）：1991-2006.

[4] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identification of the gene product[J].Journal of Bac-teriology，1987，169（12）：5429-5433.

[5] JANSEN R，EMBDEN J D A，GAASTRA W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Molecular Micro-biology，2002，43（6）：1565-1575.

[6] WIEDENHEFT B，STERNBERG S H，DOUDNA J A.RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J].Nature，2012，482（7385）：331.

[7] GUPTA D，BHATTACHARJEE O，MANDAL D，et al.CRISPR-Cas9 sy-stem：a new-fangled dawn in gene editing[J].Life Sciences，2019：116636.

[8] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.

[9] KISHI-KABOSHI M，AIDA R，SASAKI K.Genome engineering in orna-mental plants：current status and future prospects[J].Plant Physiology and Biochemistry，2018，131：47-52.

[10] KARKUTE S G，SINGH A K，GUPTA O P，et al.CRISPR/Cas9 mediated genome engineering for improvement of horticultural crops[J].Frontiers in Plant Science，2017，8：1635.

[11] SYMINGTON L S，GAUTIER J.Double-strand break end resection and repair pathway choice[J].Annual Review of Genetics，2011，45：247-271.

[12] 姚祝平，程遠，万红建，等.CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用[J].分子植物育种，2017，15（7）：2647-2655.

[13] 刘忠奇.CRISPR/Cas技术及其在作物遗传育种中的应用[J].作物研究，2019，33（3）：240-245.

[14] ZHANG Y，LIANG Z，ZONG Y，et al.Efficient and transgene-free gen-ome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA[J].Nature Communications，2016，7：12617.

[15] CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.

[16] MALI P，YANG L，ESVELT K M，et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science，2013，339（6121）：823-826.

[17] WANG L，WANG L，TAN Q，et al.Efficient inactivation of symbiotic ni-trogen fixation related genes in Lotus japonicus using CRISPR-Cas9[J].Frontiers in Plant Science，2016，7：1333.

[18] FAN D，LIU T，LI C，et al.Efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Populus in the first generation[J].Scientific Reports，2015，5：12217.

[19] YAN L，WANG X，LIU H，et al.The genome of Dendrobium officinale il-luminates the biology of the important traditional Chinese orchid herb[J].Molecular Plant，2015，8（6）：922-934.

[20] KUI L，CHEN H，ZHANG W，et al.Building a genetic manipulation tool box for orchid biology：identification of constitutive promoters and appl-ication of CRISPR/Cas9 in the orchid，Dendrobium officinale[J].Frontiers in Plant Science，2017，7：2036.

[21] MENG Y，HOU Y，WANG H ，et al.Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 system in the model legume Medicago truncatula[J].Plant Cell Re-ports，2016，36（2）：1-4.

[22] ZHANG B，YANG X，YANG C，et al.Exploiting the CRISPR/Cas9 syst-em for targeted genome mutagenesis in petunia[J].Scientific Reports，2016，6：20315.

[23] XU J，KANG B C，NAING A H，et al.CRISPR/Cas9-mediated editing of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase1 enhances Petunia flower

longevity[J].Plant Biotechnol J，2020，18（1）：287-297.

[24] WATANABE K，KOBAYASHI A，ENDO M，et al.CRISPR/Cas9-medi-ated mutagenesis of the dihydroflavonol-4-reductase-B（DFR-B）locus in the Japanese morning glory Ipomoea（Pharbitis）nil[J].Scientific Rep-orts，2017，7（1）：10028.

[25] WATANABE K，ODA-YAMAMIZO C，SAGE-ONO K，et al.Alteration of flower colour in Ipomoea nil through CRISPR/Cas9-mediated mutag-enesis of carotenoid cleavage dioxygenase 4[J].Transgenic Research，2018，27（1）：25-38.

[26] WANG W，DAI S，LI M.Physical mapping of rDNA in Dendranthema nankingense and its close related species by fluorescent in situ hybridi-zation[J].Cellular & Molecular Biology Letters，2002，7（3）：911-917.

[27] KISHI-KABOSHI M，AIDA R，SASAKI K.Generation of gene-edited Chrysanthemum morifolium using multicopy transgenes as targets and markers[J].Plant and Cell Physiology，2017，58（2）：216-226.

[28] 李翠，郝福顺，孙立荣.利用CRISPR/Cas9技术有效沉默菊花DgGA

20ox基因[J].河南科技学院学报（自然科学版），2018，46（5）：22-26.

[29] NISHIHARA M，HIGUCHI A，WATANABE A，et al.Application of the CRISPR/Cas9 system for modification of flower color in Torenia fournieri[J].BMC plant biology，2018，18（1）：331.

[30] MALARZ J，STOJAKOWSKA A，KISIEL W.Long-term cultured hairy roots of chicory：a rich source of hydroxycinnamates and 8-Deoxylactu-cin glucoside[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2013，171（7）：1589-1601.

[31] LEGRAND G，DELPORTE M，KHELIFI C，et al.Identification and cha-racterization of five BAHD acyltransferases involved in hydroxycinnam-oyl ester metabolism in chicory[J].Frontiers in Plant Science，2016，7：741.

[32] BERNARD G，GAGNEUL D，ALVES DOS SANTOS H，et al.Efficient genome editing using CRISPR/Cas9 technology in chicory[J].Internatio-nal Journal of Molecular Sciences，2019，20（5）：1155.

[33] VOYTAS D F.Plant genome engineering with sequence-specific nucle-ases[J].Annual Review of Plant Biology，2013，64：327-350.

[34] PUCHTA H，FAUSER F.Synthetic nucleases for genome engineering in plants：prospects for a bright future[J].The Plant Journal，2014，78（5）：727-741.

[35] 郭全娟，韩秋菊，张建.CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略[J].生物化学與生物物理进展，2018（8）：15-24.

[36] FU Y，FODEN J A，KHAYTER C，et al.High-frequency off-target mut-agenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J].Nature Biotechnology，2013，31（9）：822.

[37] ZHANG Q，XING H L，WANG Z P，et al.Potential high-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in Arabidopsis and its pr-evention[J].Plant Molecular Biology，2018，96（4-5）：445-456.

[38] ZAIDI S S A，MAHFOUZ M M，MANSOOR S.CRISPR-Cpf1：a new tool for plant genome editing[J].Trends in Plant Science，2017，22（7）：550-553.