女贞子醇提物对雄激素性脱发模型小鼠毛发生长的影响

刘小赟，吴小诗，潘敬灵，梁玉婷，唐春萍，沈志滨,2,3

(1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006； 2.广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006； 3.广东省化妆品工程技术研究中心，广东 广州 510006)

雄激素性脱发(androgenetic alopecia,AGA)，又称为脂溢性脱发，是一种最常见的脱发类型[1]。近年来，随着生活节奏加快与压力的增加，AGA的患病率也逐渐升高，且向年轻化发展。非那雄胺(finasteride)和米诺地尔(minoxidil)是现代临床常用于治疗AGA的药物，具有较显著的治疗效果，但与此同时具有较多的不良反应和副作用[2-3]。

女贞子是木犀科女贞属植物(LigustrumlucidumAit.)女贞果实，性凉、味干、微苦，归肝、肾经，具有明目乌发、滋补肝肾功效，常用于治疗肝肾阴虚、眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白等病证[4]。目前国内外学者对女贞子的研究主要集中在抗骨质疏松、抗癌、抗衰老、免疫调节等作用[5-6]，但女贞子醇提物对雄激素所致脱发的促毛发生长作用研究还未见报道。本文通过女贞子醇提物对模型小鼠毛发生长的影响评价其促毛发生长作用，并初步探讨其作用机制，为女贞子在预防和治疗脱发药物的进一步研究提供有价值的理论参考依据。

1 材料

1.1 主要仪器

Epoch型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV 2301-II紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；BA310-T型生物显微(麦克奥迪实业集团有限公司)；JJ-12J型脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；JB-L5型冻台(武汉俊杰电子有限公司)；KD-P型组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；GFL-230型烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)；KH-IⅡ型全自动研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)；TGL-16型高速低温离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 主要药品与试剂

女贞子(果)购买于广州同仁堂药业；二氢睾酮ELISA试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，批号 L190809514)；雌二醇ELISA试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，批号 L190923228)；睾酮ELISA试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，批号 L191014889)；丙酸睾酮(98%，上海麦克林生化科技有限公司，批号 C10232992)；5%米诺地尔酊(厦门美商医药有限公司，批号 190715)；睾酮(T，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号 G1820042)；非那雄胺(>98%，上海麦克林生化科技有限公司，批号 J1810113)；还原性辅酶II(NADPH，>98%，上海麦克林生化科技有限公司，批号 C10526802)；二硫苏糖醇(DTT，>98%，上海麦克林生化科技有限公司，批号 C10182317)；苯甲基磺酰氟(PMSF，>98%，上海麦克林生化科技有限公司公司，批号 C10090911)；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.3 实验动物

C57BL/6小鼠60只，雄性，6周龄，SPF级，体质量 18～25 g，由广东省动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002。SD大鼠，3只，雄性，9周龄，SPF级，体质量260～280 g，由广东省动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002。

2 方法

2.1 供试样品的制备

女贞子醇提物的制备：称取女贞子干燥粉末20 g，采用95%(φ)乙醇回流提取2次，料液比分别为1∶10、1∶8；提取时间分别为2 h、1.5 h；合并2次滤液，减压浓缩后，冷冻干燥制成冻干粉，得到女贞子醇提物2.054 g(提取率10.27%)，4 ℃冷藏备用；本文中女贞子醇提物均为95%乙醇提取物。

准确称取适量女贞子醇提物，采用75%(φ)乙醇溶解，配置浓度为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的女贞子醇提物溶液，作为促毛发生长作用实验中女贞子低、中、高剂量组样品溶液。

准确称取适量女贞子醇提物，采用75%的乙醇溶解，配置浓度为0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的女贞子醇提物溶液，作为Ⅱ型5α-还原酶抑制活性待测样品溶液。

2.2 女贞子醇提物对雄激素性脱发C57BL/6小鼠模型毛发生长的影响

2.2.1 动物分组及给药方式 米诺地尔是目前临床常用于治疗AGA的外用药，本实验采用其作为外用促毛发生长作用实验的阳性对照。雄性 C57BL/6小鼠60只，适应性饲养1周后，按体质量编号并用Excel软件根据体质量随机分为6组，使用脱毛膏在其背部脱除约3×4 cm2，皮肤呈粉红色且无破损，确认小鼠毛囊处于休止期。参考文献[7]进行动物造模，除空白组外，各组小鼠背部脱毛区皮肤皮下多点注射丙酸睾酮溶液5 mg/(kg·d)，丙酸睾酮处理30 min后，各组小鼠背部脱毛区域涂抹200 μL的药物溶液，每天1次，连续35 d。空白组与模型组给予75%乙醇溶液，米诺地尔组给予5%米诺地尔溶液，女贞子低、中、高剂量组给予女贞子醇提物溶液，小鼠给药剂量分别为1 mg/(只·d)、2 mg/(只·d)、4 mg/(只·d)。

2.2.2 毛发生长状况观察 每天观察各组小鼠脱毛部位皮肤及毛发生长状况，并记录每只小鼠脱毛区皮肤颜色由粉红变成黑色的时间及开始长毛发的时间，评价药物对小鼠毛发生长周期的影响。给药0、7、14、21、28、35 d时对每组拍照并记录毛发生长情况评分结果。评分标准：0分：未生长，脱毛区皮肤呈粉色；1分：脱毛区皮肤呈灰色(小于20%的增长)；2分：脱毛区皮肤呈黑色(大于20%小于40%)；3分：脱毛区皮肤呈黑色并有少许毛发生长(大于40%小于60%的生长)；4分：脱毛区皮肤呈黑色并有部分毛发生长(60%～80%的生长)；5分：脱毛区毛发基本完全生长(80%～100%的生长)[8]。

2.2.3 毛发质量的测定 取血后小鼠脱颈处死，用电动刮毛刀刮取每只小鼠背部脱毛区3×4 cm2面积的毛，用分析天平称重，求其平均值。

2.2.4 组织学观察 刮取毛后，在脱毛部位平行于脊椎处取材，将皮肤修剪成1 cm宽的长条状，置4%(φ)多聚甲醛中固定24～36 h后，冲去多聚甲醛，梯度酒精脱水，石蜡包埋，修块，切片，最后经HE染色后，置于光学显微镜下观察对比毛囊数量和形态差异。

2.2.5 血清及皮肤组织中激素含量的测定 小鼠过夜禁食，眼球取血，静置后离心(3 500 r/min，15 min)，收集上层血清；去除小鼠背部毛后，取背部皮肤，称重并加入冷却的生理盐水(1∶10，W/V)进行匀质，在相同条件下离心匀浆液，取上清。按相应试剂盒说明书，用ELISA法测定血清和皮肤匀浆中睾酮(Testosterone，T) 、二氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT) 以及雌二醇( Estradiol，E2)浓度。

2.3 女贞子醇提物对Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用

采用体外微量酶反应体系测定其对Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性。非那雄胺为特异性Ⅱ型5α-还原酶抑制剂[9]，临床常用于口服治疗雄激素依赖性疾病，本实验采用其作为阳性对照。

取雄性SD大鼠3只，禁食不禁水12 h后脱颈处死，取出腹侧前列腺及附睾并称质量，将组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(20 mmol/L磷酸缓冲液，pH 5.5，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF)在玻璃匀浆器中制成1∶5匀浆液(g/mL)，离心后合并上清液得Ⅱ型5α-还原酶。以睾酮为底物，加入Ⅱ型5α-还原酶粗酶和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)组成酶反应体系，体系组成见表1，37 ℃孵育1 h后加入2.5 mL二氯甲烷后终止反应，混匀，离心15 min(5 000 r/min)，取有机层旋干后，加入甲醇溶解定容至1 mL，用0.22 μm 滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测睾酮消耗量。试验重复3次，每次3个平行样品。

色谱条件：色谱柱(COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱(4.6 mm×250 mm，5 μm))；柱温为30 ℃；流动相为甲醇-水(70/30，V/V)；流速1 mL/min；进样量为20 μL；检测器为紫外检测器，检测波长242 nm。

通过色谱测定反应液中睾酮的含量，抑制活性的强弱用抑制率表示，公式如下：

转化率(%)=受试药物组睾酮浓度的变化值/空白对照组睾酮浓度的变化值×100%

抑制率(%)=(空白对照组睾酮浓度的变化值-受试药物组睾酮浓度的变化值)/空白对照组睾酮浓度的变化值×100%

表1 Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性研究反应体系

注：-表示该项未添加。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 女贞子醇提物对雄激素性脱发模型小鼠毛发生长的影响

3.1.1 毛发生长情况 各组小鼠毛发生长情况及毛发质量见表2，毛发生长情况评分见图1。

与空白组相比，模型组小鼠的皮肤变色时间及长毛时间均明显延长(P<0.05)，第35天时毛发质量明显减少(P<0.05)。结果表明皮下注射丙酸睾酮对C57BL/6小鼠的毛发生长具有明显的抑制作用。与模型组相比，米诺地尔组和女贞子醇提物各组的皮肤变色时间，长毛时间及毛发质量差异均有统计学意义(P<0.05)，说明米诺地尔和女贞子醇提物均在一定程度上能缓解丙酸睾酮对C57BL/6小鼠毛发生长的抑制作用。

表2 各组小鼠的毛发生长情况

组别皮肤变色时间/d皮肤长毛时间/d毛发质量/mg空白组8.5±1.9 13.5±2.2 79.92±7.41 模型组19±2.3*23±2.9*13.97±5.84*米诺地尔组10±0.8#15.6±0.9#51.68±2.12#女贞子低剂量组12.4±2.4#17.0±1.4#32.20±5.48#中剂量组13.2±2.5#16.8±2.3#44.38±3.68#高剂量组15.8±3.3#19.8±3.1#33.76±6.35#

与空白组比较：*P<0.05； 与模型组比较：#P<0.05。

图1 毛发生长情况评分
Figure 1 Hair growth score

3.1.2 组织学观察 皮肤横切面用于测定毛囊数(图2A-F)。在40倍光学显微镜下观察6个不同区域的毛囊数量，选定区域内空白组小鼠的平均毛囊数为182±5，模型组的为74±9。与空白组相比，模型组毛囊数量明显降低(P<0.05)，米诺地尔组和女贞子醇提物各组的毛囊数分别为162±22、126±18、154±21和145±22，与模型组相比有显著增加(P<0.05)。

从皮肤纵切面获得的毛囊形态如图3A-F所示，空白组小鼠的毛囊数量多且形态完整，此时毛囊已进入休止期，黑色素形成停止(图3A)；模型组毛囊形态较短且稀疏，毛囊下端退化，毛乳头变细，内毛根鞘部分消失，毛发呈杆状末端(图3B)；米诺地尔组(图3C)和女贞子醇提物(图3D-F)各组毛囊数量较多，毛囊长而大，黑色素形成明显，由此可知，米诺地尔和女贞子醇提物均能够改善丙酸睾酮引起的毛囊微型化，维持毛囊正常形态。

A.空白组； B.模型组； C.米诺地尔组； D.女贞子低剂量组； E.女贞子中剂量组； F.女贞子高剂量组。

图2 女贞子醇提物对毛囊数量的影响(HE染色，40×)

Figure 2 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on hair follicle count (HE staining,40×)

3.1.3 血清及皮肤组织中激素含量 结果见图4A-H。与空白组比较，模型组小鼠血液和皮肤组织中T和DHT含量均显著升高(P<0.05)，E2含量差异无统计学意义(P>0.05)，T/E2比值显著增大(P<0.05)；实验结果表明该雄激素源性脱发模型小鼠血液和皮肤组织中T和DHT含量升高，性激素平衡状态改变，模型建立成功。与模型组比较，女贞子醇提物低剂量组血清中T含量显著降低(P<0.05)，E2和DHT含量差异无统计学意义(P>0.05)，T/E2比值显著降低(P<0.05)；皮肤组织中的T和DHT含量均显著降低(P<0.05)，E2含量差异无统计学意义(P>0.05)，T/E2比值显著降低(P<0.05)；中剂量组与高剂量组血清和皮肤组织中T、DHT含量均显著性降低(P<0.05)，E2含量差异无统计学意义(P>0.05)，T/E2比值显著降低(P<0.05)；米诺地尔组的各项激素含量与模型组差异均无统计学意义(P>0.05)。

3.2 女贞子醇提物对Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用

配制质量浓度为1.69、3.38、6.76、13.52、27.04、54.08、108.15 μg/mL的睾酮溶液进行液相色谱分析，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，制作睾酮标准曲线。睾酮的标准曲线为Y=69 584X-37 693，R2=0.999 9，表明睾酮在1.69～108.15 μg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系，可以用于含量测定。睾酮标准溶液的液相色谱图见图5。

样品对Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性见表3。与空白对照组相比，女贞子醇提物3个剂量组的睾酮转化率差异具有统计学意义(P<0.05)，当体外剂量大于1 mg/mL时，可极显著降低睾酮转化率(P<0.01)，抑制率可达(81.49±4.03)%，具有明显抑制Ⅱ型5α-还原酶活性。

A.空白组； B.模型组； C.米诺地尔组； D.女贞子低剂量组； E.女贞子中剂量组； F.女贞子高剂量组。

图3 女贞子醇提物对毛囊状态的影响(HE染色，40×)

Figure 3 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on morphology of hair follicle (HE staining,40×)

1.空白组； 2.模型组； 3.米诺地尔组； 4.女贞子低剂量组； 5.女贞子中剂量组； 6.女贞子高剂量组。与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05。

图4 女贞子醇提物对血清和皮肤中激素水平的影响

Figure 4 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on androgen levels in serum and skin(n=10)

图5 睾酮标准溶液的液相色谱图

Figure 5 HPLC chromatogram of testosterone standard solution

表3 女贞子醇提物对Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性

组别剂量/ (mg·mL-1)转化率/%抑制率/%空白组-29.82±1.62-阳性对照组1 μmol/L 4.83±1.71**84.00±3.89女贞子低剂量组0.5 16.29±0.71*38.93±2.67中剂量组1 5.35±1.73**81.49±4.03高剂量组2 5.14±1.56**80.72±3.13

与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

C57BL/6小鼠动物模型常用于研究毛发生长周期及评估促毛发生长活性，通过对毛发生长周期和皮肤组织切片的观察，女贞子醇提物各剂量组小鼠毛发质量、毛囊数量显著增加(P<0.05),证实了女贞子醇提物对雄激素性脱发模型小鼠具有明显的促毛发生长作用。雄激素性脱发与多种因素有关，其中雄激素及Ⅱ型5α-还原酶在毛发生长中起主要的调节作用[10]，此外头发毛囊外根鞘中的P450芳香酶将雄激素转化为雌激素E2，也会抑制毛发的生长[11]。通对血清和皮肤组织中各激素水平的检测，结果表明女贞子醇提物能明显降低血清和皮肤组织中雄激素水平(P<0.05)，尤其是皮肤组织中的DHT水平，有效改善雄激素引起的毛发减少和生长缓慢的现象；而米诺地尔对睾酮引起的雄激素水平升高没有显著影响，与文献报道[12]一致，其主要育发作用机制包括扩张头皮血管，改善微循环和促进毛乳头细胞中的VEGF和FGF-7的分泌等。各实验组小鼠血清和皮肤组织中E2含量不具有显著性差异，当女贞子醇提物生药浓度为1 mg/mL时，对Ⅱ型5α-还原酶的抑制率可达(81.49±4.03)%。由此可见，在丙酸睾酮诱导产生雄激素性脱发模型小鼠的过程中，Ⅱ型5α-还原酶的活性增高起到至关重要的影响，而P450芳香酶无明显的影响作用。

有研究表明女贞子可使小鼠触须毛囊毛乳头分泌VEGF和HGF增加从而促进毛囊生长[14]，结合本研究结果，女贞子在促毛发生长过程中不仅影响重要的细胞因子，还可以降低雄激素水平，从而起到促进毛发生长，维持毛囊形态的作用，在治疗雄激素性脱发中具有一定的优势，其对头皮微循环的影响仍在进一步研究中。本研究为女贞子醇提物在预防和治疗雄激素性脱发药物的进一步研发提供了重要的参考价值。