新疆克拉玛依地区蜱媒病原体的调查

陈红娜，叶 刚，陈 银，吴治明，黄志光，鲜 军，杨维芳，崔仑标，张育富，褚宏亮

蜱属蛛形纲寄螨目，可携带病毒、细菌、寄生虫等病原体，为重要的自然疫源性疾病和人兽共患病的传播媒介。蜱种类和蜱传病原体在我国不同省份的分布不同，在空间和时间上分布不均[1]。新疆维吾尔自治区是我国最大的省份，面积占全国的1/6以上，蜱种类丰富。据文献记载新疆迄今已发现蜱类2科10属49种，占全国已知蜱类的1/3以上，新疆蜱媒疾病已经发现10多种[2]。近年，新疆边境地区毗邻的周边国家新现多种蜱传疾病，但是新疆北部的克拉玛依地区，对蜱携病原体和其所致疾病缺乏研究[3]。本研究旨在调查新疆克拉玛依地区蜱种类及其携带的病原体，为该地区蜱传疾病的防控提供依据。

1 材料和方法

1.1蜱采集与鉴定 本研究从克拉玛依市不同地区(克拉玛依、乌尔禾、独山子和白碱滩)的植被或家畜中采集蜱，收集到离心管中，记录采集点、经纬度、宿主种类、采集日期等信息。利用分类图谱对蜱的种类进行鉴定。

1.2DNA提取 按照蜱种类和采集时间、地点和寄生宿主，将1～5个成蜱放入1.5 mL EP管中。用70%的乙醇将蜱在试管中清洗3次，然后用解剖刀切开。利用组织研磨器(购于德国QIAGEN公司)研磨均化样品，按照试剂盒说明书(购于Roche公司)提取基因组DNA和RNA，-80 ℃冻存。

1.3PCR扩增 采用荧光定量RT-PCR或套式PCR试剂盒，对蜱中可能存在的多种病原体进行分子检测。采用套式和半套式PCR两种方法分别检测巴贝斯虫/泰勒虫(Babesia/Theileria)和斑点热群立克次体(Spottedfevergrouprickettsiae, SFGR)。实时荧光定量RT-PCR用于检测发热伴血小板减少综合征新布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus, SFTSV)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus, CCHFV)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV)、贝氏立克次体(Rickettsiaburnetii)、伯氏疏立克次体(Borreliaburgdorferisensu lato)和恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi, O.t)，查菲埃立克次体(ehrlichiachaffeensis)。PCR检测方法、目的基因、引物等详见表1。

表1 PCR检测方法、目的基因、引物序列
Tab.1 PCR methods，Target genes, primers sequence used for pathogens identification

病原体种类方法目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp参考文献巴贝斯虫/泰勒虫Nested PCR18S rDNABab-outF (AATTACCCAATCCTGACACAGG)Bab-outR (TTTGGCAGTAGTTCGTCTTTAACA)540[11-12]Bab-inF (GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA)Bab-inR (CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC)421新疆出血热病毒Real-time RT-PCRS segmentCCHFs-f ( TCTCAAAGAAACACGTGCC)CCHFs-r ( CYTTYTTRAACTCYTCAAACC)CCHFs-p (FAM- ACTCAAGDKAACACTGTGGGCGTAAG-BHQ)[13]恙虫病立克次体Real-time RT-PCR47-kD outer membrane protein geneOtsuFP630 (AACTGATTTTATTCAAACTAATGCTGCT)OtsuRP747 (TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT)OtsuPR665 (FAM-TGGGTAGCTTTGGTGGACCGATGTTTA-ATC T-TAMRA_)[14]斑点热群立克次体Seminested PCROmpA geneRr190-70 ( ATGGCGAATATTTCTCCAAAA)Rr190-701( GTTCCGTTAATGGCAGCATCT)632[15]Rr190-602( AGTGCAGCATTCGCTCCCCCT)532贝氏立克次体Real-time RT-PCRISllla geneISllla-f ( TGGGCTGCGTGGTGATG)ISllla-r ( TGACGTGCTGCGGACTGAT)ISllla-p (FAM- CGTGTGGAGGAGCGAACCATTGGTAT-BHQ)[16]表1(续)病原体种类方法目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp参考文献查菲埃立克次体Real-time PCR16S rRNAECH16S-17 (5-GCGGCAAGCCTAACACATG-3_)ECH16S-97 (5-CCCGTCTGCCACTAACAATTATT-3_)ECH16S-38 (5-AGTCGAACGGACAATTGCTTATAAC-CTTTTGGT-3_)[17]伯氏疏螺旋体Real-time PCR16S rRNABorre 16S-F GCTTCGCTTGTAGATGAGTCTGBorre 16S-R GCGGAAGATTCTTAGCTGCTGBorre 16S-P FAM-CCGTATCTCAGTTCCAGTGTGACCG- E-clipse)[18]布尼亚病毒Real-time PCRS segmentSFTSV-F-GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAASFTSV-R-TGCCTTCACCAAGACTATCAATGTFAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ1[19]蜱传脑炎病毒Real-time PCRNS5TBEVNS-F GATCAAGTTCAGAGCGGGAATGTBEVNS-R CGATGTCACACATGATGGTATCAGTBEVNS-P FAM-ATGTGTTCAGCATGCAACCACACCGA-BHQ[20]

1.4同源性比对分析 将阳性PCR产物送生工生物公司测序，所得测序结果通过NCBI的BLAST程序在线检索分析。本研究引用我国及其他国家和地区分离的覆盖11个基因型的18株SFGR毒株，其中嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)毒株为外群(图1)，通过MEGA 6软件绘制OmpA基因核苷酸序列进化树；26株巴贝斯虫/泰勒虫的18SrDNA基因，其中铜平鲉(SebastesCaurinus)毒株为外群(图2)绘制核苷酸序列进化树。 绘制方法为Neighbor-joining法(参数设置为500 replications)。

2 结 果

2.1蜱鉴定 从宿主动物(狗、羊、山羊、牛、马)和环境(哈罗木、沙漠、杨树)中共采集硬蜱683只，其中银盾革蜱(Dermacentorniveus) 311只 (45.53%)，亚东璃眼蜱(Hyalommaasiaticumkozlovi) 362只(53%)，图兰扇头蜱(Rhipicephalushaemaphysaloides)10只(1.47%)。

2.2病原体检测与鉴定 经PCR检测， 检测阳性率按最小概率即每份阳性样本中1只蜱阳性计算，银盾革蜱中斑点热群立克次体的阳性率为3.2%(10/311)，巴贝斯虫的阳性率为1.0%(3/311)。亚东璃眼蜱中巴贝斯虫的阳性率为0.8%(3/362)，泰勒虫阳性率为0.3%(1/362)。图兰扇头蜱中未检测到阳性病原体。SFTSV、CCHFV、TBEV、贝氏立克次体、伯氏疏立克次体、恙虫病东方体和查菲埃立克次体等检测均为阴性，且所有蜱中均未检测到两种或两种以上病原体(表2)。

2.3系统进化分析 通过同源性比对分析发现，所获SFGR阳性样本与多种已知SFGRompA基因序列同源，同源性高达93%～100%。 系统进化分析显示本研究所获10个样本均位于进化树劳氏立克次体R.raoultii分支上(图1)。 巴贝斯虫/泰勒虫目的片段18SrDNA序列分别与环形泰勒虫Theileriaannulata、驽巴贝斯虫BabesiaCaballi、BabesiaOccultans等高度同源(图2)。

表2 PCR检测蜱样本的SFG立克次体和巴贝斯虫/泰勒虫的阳性率
Tab.2 Total number of ticks (total number of pools) and the minimum field infection rate forSFGrickettsiaeandBabesia/Theileria

蜱种类总数(只)总数(份)斑点热群立克次体阳性率(%)巴贝斯虫阳性率(%)泰勒虫阳性率 (%)银盾革蜱31164103.231.000亚东璃眼蜱362920030.810.3图兰扇头蜱102000000总计683158101.560.910.2

注：“■”代表本研究所检测到的病原体样本图1 斑点热群立克次体的OmpA基因序列构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the ompA gene sequence of Rickettsia

注：“■”数字代表本研究所检测到的病原体样本。图2 巴贝斯虫/泰勒虫18S rDNA基因序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of the 18SrDNA gene sequence of Babesia/ Theileria

3 讨 论

新疆是我国蜱种多样、蜱传疾病高发地区之一，本研究中在新疆克拉玛依市4个区共采集到银盾革蜱、亚东璃眼蜱和图兰扇头蜱等3种蜱，其中荒漠中的游离蜱主要是亚东璃眼蜱，在乌尔禾区养殖基地的牛、羊身体上除亚东璃眼蜱外，有数量较多的银盾革蜱。银盾革蜱成虫主要寄生于牛、马、羊、骆驼等大型哺乳动物，也侵袭人；幼虫和若虫多寄生于啮齿类动物。2012 年田占成等报告伊犁新源县采集主要蜱种为银盾革蜱[4]。在我国已证实银盾革蜱能够传播巴贝斯虫病，从其体内分离到莱姆病螺旋体、北亚斑点热立克次体；亦有文献记载其携带克里木-刚果出血热病毒[5]。

巴贝斯虫病是由巴贝斯虫引起的一种蜱传人兽共患寄生虫病。自1982年起，我国已发现11种巴贝斯虫，已有文献报告分歧巴贝斯虫、微小巴贝斯虫和猎户巴贝斯虫引起人群感染[6]。目前，我国对巴贝斯虫病疫源地分布范围和流行规律、宿主动物和媒介蜱携带巴贝虫的能力和传播该病原体的生物学机制尚不完全清楚。弩巴贝斯虫已在我国新疆、内蒙古和甘肃省的森林革蜱和草原革蜱中检出[7-8]，我们从亚东璃眼蜱和银盾革蜱中检出弩巴贝斯虫尚属国内首次报道。

本次调查在乌尔禾区采集的银盾革蜱中检测到劳氏立克次体是一种新发现的SFGR，目前已从多个国家和地区革蜱属中检出。近几年，从我国及周边国家的革蜱属中检测到劳氏立克次体[9-10]。大多数立克次体感染的蜱是从狗、牛和植物中采集的，提示该地区存在蜱传播给动物所有者、牧羊人和农民的风险。本研究首次在新疆克拉玛依地区的银盾革蜱和亚东璃眼蜱中检测到了劳氏立克次体和弩巴贝斯虫，提示克拉玛依市及周边地区存在斑点热、巴贝斯虫病的自然疫源地，因此有必要加强对这些蜱传疾病的防控。

利益冲突：无