圈养华南虎血常规正常参考值的初步研究

李石洲 袁耀华 任小冬 陈大庆 雷胜桥 李秋明

(1.广东粤北华南虎省级自然保护区管理处，韶关，512023；2.上海动物园；上海，200335；3.苏州动物园，苏州，215000)

华南虎(Pantheratigrisamoyensis)为中国特有的虎亚种，野外已多年未发现其踪迹，现存华南虎均为20世纪50—60年代捕获的6只华南虎的后代[1]。现存华南虎分别饲养于国内各动物园和繁育基地，近亲繁殖造成的遗传多样性缺失已不可避免，母虎的受孕率与幼虎成活率极不稳定，且现存活的华南虎中出现疾病多样化趋势。由于华南虎种群小、血液样品采集困难，华南虎血液方面研究较少，可查资料不多，仅发现数篇报道有关华南虎血液指标。目前可查资料显示华南虎血常规指标的研究数据各有差异，不利于华南虎的疾病诊断和健康状况评估。动物血液指标是反映动物机体状况的重要指标，是动物疾病临床诊断和治疗的重要依据[2]。本研究从国内仅存约160只华南虎中选取部分健康的华南虎作为研究对象，采集血样对华南虎血常规各项指标进行测定和分析，形成华南虎血常规正常参考值范围，为华南虎饲养管理、疾病防治和保育繁殖等提供科学参考，帮助华南虎种群健康发展。

1 材料和方法

1.1 研究对象

本项目的研究对象为华南虎的血液，在全国人工圈养的华南虎中选择部分健康华南虎采集血液样本，血样标本制备时华南虎为空腹12 h以上。成年虎在舒泰+哆咪静的复合麻醉状态下从其后肢或尾部静脉穿刺采血，有小部分样本是在治疗夹笼控制下从尾部静脉穿刺采血，幼年虎捕捉后强制在其后肢静脉穿刺采血。检测时血清标本清晰，无溶血现象方为有效样本。把华南虎血采集在盛有抗凝剂(K3 EDTA或K2 EDTA)真空采血试管中用作血细胞分析(血常规)。血样采集后需要轻轻摇匀几次，使抗凝剂与血液混匀，放置15—20 min，并在15 min到4 h内测试，最佳测试时间为30 min到2 h。如需要运输，需在2—8 ℃密封条件下进行。由于华南虎为大型食肉类猫科动物，血液样本采集困难，2014—2017年仅采集到36只华南虎血样，有效样本30份，无效样本6份。经检测得到血常规检测报告30份，年龄性别信息见表1。

表1 有效样本的年龄和性别统计

Tab.1 Age and gender statistics for valid samples

1.2 研究设备材料和方法

主要仪器和耗材有：美国Hemavet 950 FS 兽用全自动血液细胞分析仪；配套的试剂盒(Hemavet 950 FS专用试剂包)；真空采血管-抗凝剂(K3 EDTA或K2 EDTA)、一次性采血器；电动推剪、刮毛刀等。考虑到华南虎分布在全国各地，血液采集后有效保存时间较短，空运受到限制，其他运输方式都无法确保血样及时送达实验室。因此，本项目分别在上海动物园、广州动物园设立血液检测实验室。秉着使本次试验的误差最小化原则，两家实验室均使用同一品牌、同一型号的仪器对样本进行检测。该血液细胞分析仪采用电阻抗法和射频技术，具有全自动处理和强大的软件数据管理系统，能确保获得精确的分析结果。该设备采用的聚焦流专利技术，使鞘液形成涡流，包裹在样品流周围，然后使细胞按直线逐个通过记数孔，有效地避免了计数过程中血细胞的再次循环、重叠产生的不正确脉冲，大大提高了记数的准确性，保证获得精确的结果。

1.3 血常规的数据统计和参考值范围的计算方法

应用SPSS 20软件对所有数据进行统计分析。应用Kolmogorov-Smirnov对所有血常规数据进行正态性检验，同时计算出所有指标的平均值、标准差、Kolmogorov-SmirnovZ值、渐近显著性(双侧)P值等。计算参考值范围的方法有多种，其中最基本的有正态分布法和百分位数法[3]。表1给出了两种方法90%、95%、99% 3种概率作为参考区间的计算公式[4]。2种方法比较，百分位数法适合于任何分布类型的资料，故在实际中最为常用，但由于参考值范围所涉及的常常是波动较大的两端数据，使用百分位数法必须要有较大的样本含量，否则结果很不稳定；正态分布法要求资料必须服从或近似服从正态分布，优点是结果比较稳定，在样本量不是很大的情况下仍然能够进行处理，缺点是适用范围较窄，不适合偏态分布的数据资料[4]。

2 结果

2.1 血常规各项指标的统计及正常值范围

本研究共收集血常规检验报告30份，检验时间为2014—2017年。白细胞和红细胞、血红蛋白、血小板等主要项目的数据达到30个，具备一定的统计学意义。综合考量华南虎种群数量和本次实验的实际情况后，认为95%的概率范围能较好地兼顾可信度和精确度，故本文中的医学参考值范围取95%的概率为正常值参考区间。华南虎血常规各项统计参数及正常值范围见表3。

2.2 血常规指标分析

对血常规各项指标的数据分布进行正态性检验。符合正态分布项的血常规指标正常参考值范围采用正态分布法95%概率的公式计算(表2)。经检验，血小板计数和嗜碱性粒细胞数两项指标不符合正态分布(P<0.05)，用百分位数法取95%概率计算血小板计数和嗜碱性粒细胞数的正常参考值范围(表3)。

表2 医学参考值范围的正态分布法和百分位数法计算公式[4]

Tab.2 Formulas of normal distribution method and percentile method for calculating the range of medical reference values

注：X^表示均值，S表示标准差，Pm表示第m百分位数

Note：X^is the mean value，Sis the standard deviation，Pmstands for them-th percentile

表3 华南虎血常规各项统计参数及正常值范围

Tab.3 Statistical parameters and normal range of blood routine of South China tiger

注：X^表示均值，S表示标准差；**渐近显著性(双侧)即为正态性检验中P值

Note：X^is the mean value，Sis the standard deviation.**The asymptotical significance(both sides)isP

2.3 差异性分析

研究血常规指标，必须进行年龄、性别等各种影响因素的差异性分析。我们采用单因素方差分析方法，对年龄、性别两组进行组间差异显著性分析。如按性别分组后雌雄比例为13∶17，假设各项指标组间差异不显著进行独立样本t检验，结果显示，各项血常规指标的差异显著性均大于0.05，证明假设成立，即华南虎血常规雌、雄两组差异不显著。按年龄分组，幼龄组与成年组比例为14∶16，假设各项指标组间差异不显著进行独立样本t检验，组间检验各项血常规指标的Sig值均大于0.05，证明假设成立，即华南虎血常规幼龄组与成年组差异不显著。因此，不同性别、年龄间华南虎血常规各项指标差异不显著。

3 讨论

3.1 技术方法比较

目前，国内外对虎的血液指标研究较少，技术方法也各有不同。如张锡然等[5]关于东北虎(Pantheratigrisaltaica)和华南虎血象测定使用的血球计数板和光电比色法，检测血常规指标8项；凌明德等[6]关于华南虎血常规测定使用也是血球计数板和光电比色法，检测血常规指标9项；阿布力孜·阿布力米提等[7]关于东北虎和孟加拉白虎(Pantheratigristigris)的血常规指标，检测项目达18项。本文使用全自动(兽用)血液细胞分析仪，采用电阻抗法和射频技术，本项目检测血常规指标共23项，较全面地对华南虎血常规指标进行了测定。较早期华南虎血常规的检验主要依靠手工计数等方法，在实验过程中存在较多可能产生误差的步骤，随着技术的发展，现大多数仪器均能做到全自动分析结果，减少了手工计数等可能产生误差的环节，保证了检验结果的精确性。

3.2 条件假设和误差控制

影响血常规检验的主要因素可归纳为人为因素、生理因素、仪器因素、试剂因素等几个方面，这些方面分别在检验的不同阶段影响结果[8]。在华南虎的血常规检验中，这些影响因素同样存在，还有更多影响因素不能忽视。如华南虎难以控制采血，各地饲养条件等不同，可供研究的样本量极少。所以我们把从外观、行为等比较正常且无明显疾病的华南虎都暂认为其是正常的。因此，在影响被研究指标主要的可控制因素达到相同或基本相同就认为是同质，本文假设所有参加实验的华南虎都是在同质的条件下进行的。在本文所述研究中，通过人员培训、控制检测程序等措施，来减少各种因素对检验结果的影响。血小板的主要生理功能是参与凝血和止血，表2中血小板的渐近显著性(双侧)为0.033，不符合正态分布，且与张锡然等[5]、凌明德等[6]报道的参数有一定差别，这种差别产生的原因可能是采血方式、测定方法、华南虎饲养条件等不同而造成。本文按已得数据计算血小板的正常值范围，对血小板的影响因素需要进行进一步研究。

3.3 华南虎血常规的比较

由于华南虎血常规指标的研究较少，本文将2篇华南虎血液指标相关论文中的数据进行部分比较。张锡然等[5]测定部分项目的均值和范围分别为白细胞8.73(5.5—19.0)103/mL、红细胞652.30(443—769)104/mL、血小板13.40(6.2—32.0)104/mL、血红蛋白12.68(11.3—14.0)g/mL，与本文所得结果有一定的差别，可能是检测方法、仪器、华南虎饲养条件等与现在有很大的不同，造成一定的差别。凌铭德等[6]测定的白细胞计数(5.8—28.2)109/L，其范围明显大于本研究的白细胞计数范围(8.54—23.77)109/L，但其雌性、雄性、幼虎的均值分别为11.75×109/L、11.95×109/L、13.89×109/L，与本文得到的均值12.19×109/L较为接近，其中大部分项目与本文中统计结果相近。

3.4 其他虎亚种相关研究结果比对与讨论

为研究华南虎与其他虎亚种在血常规各项指标之间有无差异，本文对已有的关于孟加拉虎、东北虎、白虎的血常规指标进行了对比分析。张锡然等[5]测定东北虎的部分血常规指标的均值和范围分别为白细胞8.92(4.0—14.0)103/mL、红细胞683.8(530—940)104/mL、血小板15.67(6.2—39.8)104/mL、血红蛋白12.99(9.5—19.7)g/mL等，与本文所得结果差别不大。阿布力孜·阿布力米提等[7]测定东北虎和孟加拉白虎的血常规各项指标的均值和标准差与本文结果均存在较大差别，可能与该文选取的虎均为幼虎有一定关系，但其所述范围均在本文所得正常值范围内。张红绪等[9]测定的东北虎幼体白细胞(16.59±2.74)109/L、红细胞(6.82±0.60)1012/L、血红蛋白(118.92±17.24)g/L、血小板(415.38±71.51)109/L，其白细胞均值明显大于本研究的(12.19±3.44)109/L，红细胞均值小于本文的(8.08±1.09)1012/L，血红蛋白均值也明显小于本文(144.50±21.57)g/L，血小板均值大于本文的(369.83±632.35)109/L。而Shrivatav等[10]报道孟加拉虎部分血常规的范围和平均值为：白细胞(6.2—11.05)、(8.5±1.49)103/μL，红细胞(4.66—9.15)、(7.9±1.42)106/μL；血红蛋白(7.8—13.8)、(12.8±1.65)g/dL等，其红细胞的范围和平均值与本文结果近似，但白细胞、血红蛋白的均值和范围都明显小于本文所得结果。由此发现，华南虎与其他虎亚种血常规的各项指标存在一定差别。华南虎血常规指标正常参考值范围不同于其他虎亚种，建立华南虎血常规指标正常值对华南虎的饲养管理、疾病诊治预防和保育繁殖研究工作很有必要。

致谢：本文血液检测由上海动物园和广州动物园完成；上海、广州、苏州、南昌动物园等提供华南虎血液标本；除本项目参加人员外，南昌动物园黄薇、韶关华南虎基地刘力军等对本项目给予了大力支持，在此一并感谢。