实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展

梁子英 刘芳

摘要    实时荧光定量PCR技术是在传统PCR技术上发展而来的，不仅能判断某一基因的有无，而且还能对其进行定量分析。由于该技术与常规PCR相比，能够进行实时监测、自动化程度高而被广大研究者青睐。本文对实时荧光定量PCR的原理、数据分析、定量方法、分类以及应用进行了系统而详细的综述。

关键词    荧光定量PCR;原理;定量方法;分类;应用

中图分类号    Q503        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）06-0001-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Research  Progress  on  Real-time  Quantitative  PCR  Technology  and  Its  Application

LIANG Zi-ying    LIU Fang *

（College of Biological Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193）

Abstract    Real-time quantitative PCR technology is developed from traditional PCR technology.It can not only judge the presence or absence of a certain gene，but also perform quantitative analysis on it.Compared with conventional PCR，this technology is capable of real-time monitoring and has a high degree of automation，which is favored by researchers.In this paper，the principles，data analysis，quantitative methods，classification and applications of real-time quantitative PCR were reviewed systematically and in detail.

Key words    real-time quantitative PCR;principle;quantitative method;classification;application

1    实时荧光定量PCR技术的原理及数据分析

1.1    实时荧光定量PCR的原理

实时荧光定量PCR与常规PCR相比，主要体现在荧光、实时与定量3个关键词上。荧光是指在标准PCR体系中加入了荧光物质;实时是指通过荧光信号的积累能够实时监测每次循环后PCR产物的变化，并生成荧光扩增曲线;定量是指该技术能够实现对初始模板的定量分析。

实时荧光定量PCR的扩增曲线可由4个时期进行描述，即基线期、指数增长期、线性增长期与平台期。在基线期部分，强背景信号掩盖了微弱的荧光信号，故此时期无法对模板的起始量进行分析。反应进入平台期，反应管内的dNTP、酶等被耗尽，反应环境已不适合PCR反应的进行，此时的PCR产物不再增加，荧光信号达到水平状态，且同一模板的多次技术重复的扩增曲线在该时期重复性差、可变性高，故在这一时期同样不适合进行模板初始量的分析。在线性增长期，虽然PCR反应仍在进行，但产物已不再呈指数形式增加，在该时期也不适合模板初始量的分析。在指数增长期，反应各组分（引物、dNTP、Mg+、酶）均过量，反应所需的环境适中，聚合酶活性仍较高，该时期的扩增效率高，产物数量以指数形式增加，且与初始模板量成线性相关[1]。另外，在指数增长期内，同一模板的多个技术重复具有高度的重复性，在这一时期进行数据分析具有可靠性。

实时荧光定量PCR中的3个概念，即基线、阈值与CT值是理解其原理的关键。在线性图谱中，基线体现在与X轴平行的部分，对数图谱中，它体现在背景信号杂乱的部分，系统会自动形成基线的起始循环数与终止循环数，也可手动调节。荧光阈值指的是荧光强度值，将它界定为3～15个循环的荧光信号标准差的10倍[2]，在扩增曲线里，穿过阈值与X轴形成的平行线即为阈值线，系统可自动形成也可手动设置，手动设定阈值时，在指数增长期内重复性好的范围内上下调节。CT值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数[3]，与靶点的初始量成反比。整个扩增过程，基线决定阈值，阈值决定CT值，为了保证试验结果的准确性，需保证扩增曲线的基线以及阈值设置的合理性。系统一般将基线起始循环数设为3，正确的基线终止循环数很重要，若背景信号过强，系统会将背景信号误判为扩增信号，自动生成的基线范围比实际范围小，影响扩增曲线的帶型以及最终检测到的CT值，这种情况可手动设置基线终止循环数，一般将其设为该样品开始扩增的前一个循环。

1.2    实时荧光定量PCR的数据分析

在指数增长期，PCR产物量以指数形式增加，根据这一原则，假设扩增效率为E，模板起始量为N0，m个循环后PCR产物量为Nm，则有Nm=N0（1+E）m（1），对该等式两边取对数，则有LgN0=-m·lg（1+E）+Lg Nm（2），若循环数达到某一CT值时，荧光阈值为Q，式（1）可写成：Q=N0（1+E）CT，式（2）可写成：LgN0=-CT·lg（1+E）+LgQ。当需要对靶基因在mRNA水平上进行表达量分析时，通常采用式（1）进行数据分析。当需要对靶基因拷贝数进行绝对定量时，则需要用式（2）进行数据分析。

2    实时荧光定量PCR技术的定量方法

“绝对定量”与“相对定量”是实时荧光定量PCR的2种定量方法[4]，研究者可选择适合自身研究的定量方法。

2.1    绝对定量法

绝对定量法也称作标准曲线法[5]，是一种利用已知的标准曲线来定量未知样本目的模板起始量的方法。以5点梯度稀释所得的标准品为模板，经实时荧光定量PCR扩增，以目的模板初始拷贝数的对数为横坐标，检测到的CT值为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程，将未知样本的CT值带入该方程即可计算出目的模板的起始量。标准曲线的各项指标：斜率、扩增效率（E）、相关系数（R2）、间距均需进行严格评价，从而确保该曲线的可用性。各点间距应相等，间距以及斜率的绝对值应满足3.100～3.582，相关系数R2>0.99，扩增效率（E）在90%～110%之间。扩增效率、斜率以及间距三者相互关联，扩增效率（E）=10（-1/斜率）-1，斜率的绝对值恰是各点之间的平均间距。当扩增效率<90%时，间距以及斜率的绝对值会>3.582;当扩增效率>110%时，间距以及斜率的绝对值会<3.10，故扩增效率越低，斜率的绝对值越大，间距越宽;扩增效率越高，斜率的绝对值越小，间距越窄。扩增效率过低，酶的活性可能出现了问题，或反应体系不适合反应的有效进行。若扩增效率过高，反应管内可能存在目的基因扩增之外的其他非特异扩增，需要对引物进行一个溶解曲线的检测，优化反应体系以及反应程序。

2.2    相对定量法

相对定量可分析某一靶基因在不同样品之间、同一样品的不同部位之间以及某一样品的某一部位在不同动态时期之间的mRNA水平上表达量的比值，也可分析靶基因与内参基因在同一样品中拷贝数的比值。在相对定量中，需要用内参基因来消除因模板浓度不同所带来的误差，进而对靶基因的初始量进行校正[6]。常用的有2-ΔΔCT法[7]，双标准曲线法[8-9]。

2.2.1    2-ΔΔCT法。使用該方法的前提是靶基因与内参基因的扩增效率相等且均为100%[10]，假设靶基因在处理组与对照组中的初始量分别为N1与N2，当达到某一荧光阈值时，靶基因在处理组与对照组中的阈值循环数分别为CT1与CT2，则有C1·N1·2C2·N2·2（C1、C2分别为处理组与对照组的浓度），假设内参基因在处理组与对照组中的初始量分别为N1′与N2′，当达到某一荧光阈值时，内参基因在处理组与对照组中的阈值循环数分别为CT1′与CT2′，则有C1·N1′·2=C2·N2′·2，故有，C1·N1·2/C1·N1′·2=C2·N2·2/C2·N2′·2，由于内参基因在处理组与对照组中的初始量是相同的，即N1′=N2′，故靶基因在处理组与对照组中的比值N1/N2=2，即N1/N2=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=ΔCT处理组-ΔCT对照组=（CT靶基因-CT内参基因）处理组-（CT靶基因-CT内参基因）对照组。该方法不需要生成标准曲线，操作简便、效率高，但靶基因以及内参基因的扩增效率需达100%。此方法通常用于某一基因在mRNA水平上的表达量分析。

2.2.2    双标准曲线法。双标准曲线即靶基因以及内参基因各对应的一套标准曲线。假设靶基因的平均扩增效率为E3，在待测样品以及校准样品中的初始拷贝数分别为N3与N4，当达到某一阈值时，该靶基因在待测样品以及校准样品中检测到的CT值分别为CT3与CT4，则有C3·N3·（1+E3）=C4·N4·（1+E3）（其中，C3与C4分别为待测样品以及校准样品的浓度），假设内参基因的平均扩增效率为E4，内参基因在待测样品以及校准样品中的初始拷贝数分别为N3′与N4′，当达到某一阈值时，内参基因在待测样品以及校准样品中检测到的CT值分别为CT3′与CT4′，则有C3·N3′·（1+E4）=C4·N4′·（1+E4），则靶基因与内参基因在待测样品中的拷贝数比值N3/N3′=N4/N4′·（（1+E3）/（1+E4）），其中，N4为靶基因在校准样品中的初始拷贝数，校准样品中靶基因的拷贝数是已知的，并且是经过Southern杂交验证的;N3′与N4′是指内参基因在待测样品以及校准样品中的初始拷贝数，在拷贝数变异检测中，内参基因需具有“同一物种内具有恒定低拷贝”这一特点，也就是N3′=N4′，故靶基因在待测样品中的初始拷贝数N3=N4·（1+E3）/（1+E4）。利用该方法需生成标准曲线，操作严谨复杂，但计算结果准确，误差小，对结果要求较高的分析通常采用该方法。

3    实时荧光定量PCR技术的分类

3.1    DNA染料法

用于实时荧光定量PCR的DNA染料有SYBR Green I、SYBR Gold、EvaGreeEB与EB。SYBR Green I是目前试验过程中最常用的一种，该染料结合于双链DNA的小沟处[11]，游离的染料分子只发出微弱的荧光，锚定到双链DNA上的染料才会发出强荧光。在PCR延伸阶段，SYBR Green I染料结合上去，发出荧光，双链合成越多，荧光强度越强。SYBR Green I与DNA的结合具有非特异性，除了与目的片段结合外，还能与其他非目的片段的双链DNA分子结合，如非特异性扩增产物、引物二聚体。为了检测产物中是否含有非特异或引物二聚体，在PCR反应结束后进行一个溶解曲线分析，即温度从50 ℃升高到95 ℃，监测这一过程中荧光信号的变化情况，用荧光信号变化的速度与温度作图，形成溶解曲线，若未形成非特异或引物二聚体，特征峰只有1个，且相同基因形成特征峰的Tm值相同;若有非特异或引物二聚体时，就会出现特征峰之外的杂峰。由于染料法对双链DNA的识别不具有特异性，所以试验过程中需要合理地设计引物。

3.2    荧光探针法

荧光探针是指在寡聚核苷酸上结合荧光报告基团与荧光淬灭基团，由激发态的报告基团回到基态的过程会释放荧光，当报告基团与淬灭基团离得很近时，激发态的报告基团会将荧光传递给淬灭基团从而不发射荧光。荧光探针法大体上分为水解探针法、双联置换探针法和杂交探针法。

3.2.1    水解探针法。水解探针的结构特点是寡核苷酸序列的5′端为荧光报告基团，3′端为荧光淬灭基团。PCR扩增前，探针游离于靶序列外，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光，但有时会因淬灭不彻底，会检测到微弱的荧光。在PCR退火时，探针特异性地结合到靶序列上，在延伸阶段，利用Taq酶5′-3′外切酶的活性将探针水解，荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光信号被释放，并与PCR产物的数量成正相关。由于水解探针的作用机理依赖于Taq酶5′-3′外切酶的活性，所以水解探针又称为Taqman探针。

在Taqman探针的基础上研发出了Taqman MGB探针，该探针的3′端除了有淬灭基团外，增加了一种MGB基团，该基团能够与双链DNA的小沟结合，使探针与靶序列的亲和力增强，探针Tm可提升10度左右，长度可适当减少，降低了合成成本[3]。另外，Taqman MGB探针3′端的淬灭基团本身不发荧光，从而降低了荧光本底信号。

3.2.2    双链置换探针法。双链置换探针的特点是由正负两条链组成，互补结合，正链的5′端标记有荧光基团，3′端通过结合磷酸基团或氨基基团来阻止其延伸，负链的5′端比正链少1～5个碱基，3′端标记有淬灭基团。当体系中无靶序列时，正链与负链处于结合状态，两端的荧光基团离得很近，检测不到荧光信号，当有靶序列存在时，正链就会与靶序列结合从而将负链释放出去，2条链上的荧光基团分离，能检测到荧光信号。相较与水解探针，双链置换探针的荧光基团以及淬灭基团相互作用得更牢固，产生的本底信号更低[12]。

3.2.3    杂交探针。杂交探针中最常用的是分子信标与双杂交探针。游离状态下的分子信标是一种“茎-环”结构，其环状部位与靶序列互补结合，两侧的茎臂互补结合，且与靶序列无同源性，在两侧茎的3′与5′端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团。当分子信标游离于靶序列时，两茎臂上的荧光基团离得很近，检测不到荧光，在PCR退火阶段，环状部位与靶序列结合，两茎臂的互补结构被破坏，两端的荧光基团分离，荧光信号被释放。

双杂交探针是由一对探针组成，其结构特点是2条探针能够与靶序列上的相邻部位结合[13]，其中一个探针的5′端为荧光受体基团，另一个探针的3′端为荧光供体基团。在退火阶段，两探针以首尾相接的方式结合到靶序列上，2个基团离得很近，供体基团激发后产生的荧光能量被受体基团吸收，此时可以检测到受体发出的荧光。当这对探针处于游离状态时，2个基团离的远，检测不到受体基团发出的荧光。

4    实时荧光定量PCR技术的应用

由于实时荧光定量PCR技术较常规PCR技术相比，具有污染少、定量准确、实时监测、自动化程度高等优点，该技术已被应用于转基因检测、作物育种、环境科学以及医学等领域。

4.1    在转基因生物中的应用

4.1.1    在转基因成分检测中的应用。开发与完善转基因成分检测技术已成为对转基因产品进行标识管理，进而维护消费者知情权的一种必然趋势。标识的阈值是指产品中含有的转基因作物的百分比，这就需要转基因检测方法不能仅仅停留在定性检测上，还需要进行定量检测，实时荧光定量PCR技术是目前广泛应用的定量检测技术。自Vaitilingom等[14]首次将该技术应用到转基因产品的定量检测上以来，该技术已被广泛应用于玉米、大豆、水稻、小麦、番木瓜等转基因生物目的基因的定量检测中[15-19]。荧光定量PCR技术不仅能够实现单一基因的检测，还能同时实现多个基因的检测，在保证准确性的同时大大提高了通量。

4.1.2    在转基因新品种育种过程中的应用。在转基因过程中，外源基因的插入位点以及数目都是随机的，插入的拷贝数低（1或2），能很好地表達，拷贝数高反而表达不稳定甚至沉默。因此，必须对转基因T0代的拷贝数进行检测，保留低拷贝（1或2拷贝），弃掉高拷贝。T0自交得到的T1是处于分离状态的，当T0为1拷贝时，T1会出现0、1、2这3种拷贝数类型，0拷贝的植株是不含外源基因的，在压力筛选过程中被淘汰，1拷贝的T1单株在自交下一代中仍会出现分离，2拷贝单株的自交后代仍为2拷贝，不再分离，故2拷贝单株是纯系单株。当T0为2拷贝时，T1会出现0、1、2、3、4这5种拷贝数类型，1、2、3这3种拷贝数类型的单株的下一代仍会出现分离，4拷贝单株的自交后代拷贝数仍为4，不再分离，在此种情况下，4拷贝单株是纯系单株。为了更快更早地拿到纯系单株，通过检测T1单株外源基因的拷贝数即可判断出纯系单株，再通过对T2代进行拷贝数检测，完成纯系验证，通过这种方式可以快速准确地拿到纯系种子。通过检测T0以及T1植株外源基因的拷贝数即可拿到纯系T1单株，最终，纯合的T1自交可得到纯合的T2种子，再对纯合的T2植株进行表达量分析，只有对纯合的、过表达的T2植物的表型及功能的研究才是有意义的，用该方式获得过表达的纯系T2，与传统的育种方法相比，大大地缩短了育种年限。然而，无论在T0、T1以及T2中的外源基因拷贝数的检测，还是对纯合T2的表达量分析，均可以通过实时荧光定量PCR技术来实现，准确性高，通量大，适用于大批次样品的检测。

4.2    在农作物育种中的应用

分子标记辅助育种中的单核苷酸多态性标记SNP技术因在全基因组中覆盖率广、图谱密度高而被广泛地开发与利用。SNP位点的检测方法有测序法、单链构象多态性分析法、变性高效液相色谱法、寡核苷酸链连接分析法、基于荧光定量PCR的Taqman探针法与HRM法。其中，测序法、单链构象多态性分析法与变性高效液相色谱法均因成本高、通量低而未得到广泛使用，寡核苷酸链连接分析法由于可操作性差也未被广泛使用。基于荧光定量PCR的Taqman探针法与HRM法因其通量高、在封闭的环境中进行反应、污染率低等优点而被广泛地利用。

4.3    在其他方面的应用

荧光定量PCR技术在食品监测以及环境监测中均有应用。食品中可能含有一些有害的细菌，利用荧光定量PCR技术可对食品中的某一细菌进行定量分析[20]，灵敏度和可靠性高。环境中的微生物[21]，如大气环境中的大肠杆菌，水环境中的蓝细菌、赤潮藻、假单胞菌，土环境中的炭疽芽孢杆菌是否超标，严重影响着人类、水生生物以及植物的健康生长，荧光定量PCR技术能对其实现定量分析，对环境进行检测。另外，荧光定量PCR技术也广泛应用于医学，如癌症的诊断、病原体的感染以及基因缺陷性疾病的检测。

5    参考文献

[1] 王甜，陈庆富.荧光定量PCR技术研究进展及其在植物遗传育种中的应用[J].种子，2007（2）：56-61.

[2] 王秀娟，肖瑞，姜丽丽，等.实时荧光定量PCR的原理及其医学应用[J].疾病监测与控制，2013，7（5）：284-286.

[3] 马月萍，戴思兰，马艳蓉.荧光定量PCR技术在植物研究中的应用[J].生物技术通报，2011（7）：37-45.

[4] GINZINGER D G.Gene quantification using real-time quantitative PCR：an emerging technology hits the mainstream[J].Exp Hematol，2002，30（6）：503-512.

[5] BUSTIN S A.Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J Mol Endocrinol，2000， 25（2）：169-193.

[6] HAN X，LIU M，QIAO G，et a1.Selection and validation of reference genes for real-time quantitative PCR in hyper accumulating ecotype of Sedum alfredii under different heavy metals stresses[J].PLoS 0ne，2013，8（12）：82927.

[7] PFALL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res，2001，29（9）：45.

[8] RUTLEDGE R G.Mathematics of quantitative kinetic PCR and theappli-cation of standard curves [J].Nucleic Acids Res，2003，31（16）：93.

[9] 徐丽华，刘春雷，常玉梅，等.双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法[J].生物技术通报，2011（1）：70- 75.

[10] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delt Delt C（T））Method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[11] NAVARRO E，SERRANO-HERAS G，CASTANO M J，et al.Real-time PCR detection chemistry[J].Clinica Chimica Acta，2015（439）：231.

[12] CHENG J，ZHANG Y，LI Q.Real time PCR genotyping using displacing probes [J].Nucleic Acids Res，2004，32（7）：61.

[13] DIDENKO V V.DNA probes using fluorescence resonance energy transfer（FRET）：designs and applications[J].Biotechniques，2001，31（5）：1106.

[14] VAITILINGOM M，PIJNENBURG H，GENDRE F，et al.Real-time qua-ntitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and roundup ready soybean in some representative foods[J].J Agric Food Chem，1999，47（12）：5261-5266.

[15] 陈颖，徐宝梁，苏宁，等.实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究[J].作物学报，2004（6）：602-607.

[16] 吴影，宋丰顺，陆徐忠，等.实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究[J].作物学报，2007（10）：1733-1737.

[17] 王育花，赵森，陈芬，等.利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究[J].生命科学研究，2007（4）：301-305.

[18] 甄贞，段俊枝，于艳波，等.转基因小麦B73-6-1外源基因拷贝数的确定[J].河南农业科学，2016，45（4）：19-22.

[19] 任君安.玉米和番木瓜等产品中转基因成分检测技术研究[D].北京：北京林业大学，2013.

[20] 张慧敏，夏海磊，王梦琦，等.荧光定量PCR检测原料乳中鲁氏不动杆菌方法的建立[J].食品工業科技，2017，38（3）：309-313.

[21] 倪敏，章豪，刘婷婷，等.实时荧光定量PCR在污水处理活性污泥中的应用[J].苏州科技大学学报（工程技术版），2019，32（1）：10-14.