益气温阳方对变应性鼻炎小鼠NK细胞细胞因子分化影响的研究

严芮雯,陈旭青,严道南

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210000；2.南京中医药大学附属第一医院,江苏省中医院，江苏 南京 210000)

过敏性鼻炎是常见的发生在鼻部的非感染性炎性疾病(Ⅰ型变态反应),临床症状严重影响了人们的生活、工作、学习，尤其影响了儿童的生长发育。NK细胞是人体非特异性免疫系统的组成部分，是机体抗病毒、抗感染以及机体免疫调节中不容忽视的效应细胞。实验研究发现，类似于T细胞，NK细胞在不同的条件下亦分化为NK1/NK2型细胞亚群。临床研究表明，益气温阳方治疗变应性鼻炎肺脾虚寒证有很好的疗效，能很好的缓解变应性鼻炎临床症状[1]。本研究主要通过研究益气温阳方对NK细胞刺激活化后的亚群NK1型细胞、NK2型细胞细胞因子IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ的影响，来分析益气温阳方对NK细胞分化的影响，初步探讨益气温阳方对变应性鼻炎患者机体免疫细胞NK细胞的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级C57BL/6小鼠30只，体质量25～30 g，由南京中医药大学动物中心提供，按5只/笼饲养于SPF级别饲养环境，自由进食饮水。

1.1.2 主要仪器

酶标仪(美国BioTekInstruments公司)；CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)；37 ℃恒温箱(北京福意联医疗设备有限公司)；小型台式高速离心机(德国 Sigma公司)。

1.1.3 试剂

IL-5 Mouse ELISAKit(美国 eBioscience)；IL-5 Mouse ELISA Kit(美国 eBioscience)；RPMI 1640培养液(美国 Gbico公司)；OVA(美国Sigma公司)。

1.1.4 药物

益气温阳方组成：党参10 g，黄芪15 g，干姜9 g，桂枝10 g，麻黄6 g，五味子10 g，地龙10 g，乌梅10 g和甘草3 g。加水常规煎煮，滤液分别浓缩至1.4 g/mL、0.7 g/mL、0.35 g/mL，4 ℃保存。

盐酸左西替利嗪片由重庆华邦制药有限公司生产，5 mg×15片。

刺激剂：高尔基体+粉尘螨代谢培养基提取液，过滤除菌，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型准备

30只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、益气温阳方低剂量组、益气温阳方中剂量组、益气温阳方高剂量组和西替利嗪组共6组。除空白组外，在第0天、第7天，第14天以40 μg的OVA作抗原，2 mg氢氧化铝作免疫佐剂，加0.9% NaCl溶液定容至400 μL，腹腔注射小鼠进行致敏，空白组以等量生理盐水代替；从第21天开始，用10%的OVA 溶液滴入小鼠鼻腔，每侧各20 μL进行激发，每天激发1次，持续7 d，空白组以等量生理盐水代替。

1.2.2 药物干预

自造模第21天～第27天，对小鼠进行灌胃，益气温阳方低剂量组、中剂量组、高剂量组以及西替利嗪组分别按0.07 g/(10 g·d)、0.14 g/(10 g·d)、0.28 g/(10 g·d)、16.67 μg/(10 g·d)给药，各组均按0.2 mL/(10 g·d)液体量灌胃，模型组和空白组以等量生理盐水灌胃。

1.2.3 取含药血清

灌胃7 d后采用腹主动脉真空采血管取血，室温静置1 h，2 500 r/min，4 ℃离心20 min，分离血清，56 ℃水浴灭活30 min，过滤除菌，-20 ℃保存。

1.2.4 原代NK细胞的分离纯化

取正常小鼠，处死后分离脾脏，移至操作显微镜下，剥离血管膜，剪碎组织；以0.125%胰酶混悬后放入CO2培养箱中消化20 min，5 min摇晃一次；加入1 mL血清终止消化，静置2 min后移去上清；加入2 mL全培缓慢、连续吹打10次，静置后吸取上清，反复3次，取得单细胞混悬液；参照NK Cell Isolation KitⅡ试剂盒，以磁性纳米微球结合NK细胞特异性抗原，将结合后的细胞混悬液经过特定磁场吸附NK细胞，分离得到NK细胞混悬液。

1.2.5 体外刺激NK细胞

10%含药或空白血清RPMI 1640完全培养基制备3.75×105个/mL NK细胞混悬液，移500 μL细胞混悬液于24孔内，除空白组外，每组加入高基体阻断剂+佛波酯+离子霉素或高基体阻断剂+尘螨试剂； CO2培养箱孵育24 h。

1.2.6 ELISA检测细胞因子IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ

回收上清，采用Elisa技术，参照试剂盒说明书，分别检测IL-5、IL-10、IL-4、INF-γ的样本含量。

1.2.7 统计学方法

2 结果

2.1 干预及造模期间动物一般状态

灌胃第3天，部分西替利嗪组及益气温阳方高剂量组小鼠大便稀，灌胃第5天，1只益气温阳方中剂量组小鼠由于灌胃针刺较深，小鼠抽搐死亡。余小鼠在干预及造模期间无特殊情况，毛色、摄食量、行为、大小便等一般状态基本正常。

2.2 NK细胞混悬液流式纯度检测

本次实验研究对象为CD3-、CD16+、CD56+NK细胞，提取的NK细胞流式纯度检测结果如图1示，CD3目标抗原没有表达(染色阴性)，CD56和CD16两种目标抗原都有表达(双阳性)。

图1 NK细胞混悬液流式纯度检测

2.3 细胞因子检测结果

益气温阳方能抑制NK2型细胞细胞因子IL-4、IL-5分泌(P<0.05)，其中益气温阳方中剂量组抑制NK2型细胞细胞因子IL-4、IL-5分泌作用最明显(P<0.05)，与西替利嗪组差异无统计学意义(P>0.05)。益气温阳方对能促进NK1型细胞细胞因子IL-10分泌(P<0.05)，其中益气温阳方中剂量组对促进NK1型细胞细胞因子IL-10分泌作用最明显(P<0.05)，但益气温阳方对NK1型细胞因子INF-γ分泌无促进作用(P<0.05)。西替利嗪组能抑制NK2型细胞细胞因子IL-4、IL-5分泌(P<0.05)，抑制作用高于益气温阳方低、高剂量组(P<0.05)，与益气温阳方中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；西替利嗪组能促进NK1型细胞细胞因子IL-10分泌(P<0.05)，效果均高于益气温阳方组(P<0.05)；但西替利嗪组对NK1型细胞因子INF-γ分泌无促进作用(P>0.05)。结果见表1。

表1 各组细胞因子水平比较

注：与模型组比较，*P<0.05;与空白组比较，△P<0.05。

3 讨论

NK细胞是能够分泌免疫细胞因子的效应淋巴细胞，具有固有免疫和适应性免疫双重特性。大量实验证明变应性鼻炎主要是由IgE介导的，多种免疫细胞、免疫调节因子参与的细胞免疫系统紊乱的鼻黏膜变态反应，而NK细胞作为免疫淋巴细胞，是维持免疫环境的稳定以及机体正常免疫功能的重要一员。因此当过敏反应发生时，免疫功能失常，刺激NK细胞活化，诱导NK细胞分化成NK1和NK2型细胞，分泌出一系列促炎反应类以及免疫抑制类细胞因子，变应性鼻炎患者表现为明显的NK2型偏倚。

NK细胞通常是CD3-、CD56+、CD16+，TCR-，BCR-的淋巴样细胞，CD56+NK细胞亚群主要参与细胞因子的分泌，本实验提取培养的主要为CD56+NK细胞亚群。在临床研究中，Peritt等[2]发现在一定条件下培育CD16+或CD56+NK细胞，能诱导出分泌INF-γ的NK1型亚群和分泌IL-5和IL-13的NK2型亚群。Katsumoto等[3]认为IL-2和IL-12能诱导NK1型细胞分泌INF-γ、IL-10，NK2型亚群产生IL-5和IL-13，NK2型偏倚的原因主要是由于INF-γ减少，而Wei等(4)认为NK2型偏倚的原因主要是IL-4的增多。本次实验研究发现，变应性鼻炎小鼠NK细胞细胞因子INF-γ、IL-4分泌增多明显，表明变应性鼻炎小鼠NK2型偏倚可能主要是由于IL-4的增多。

变应性鼻炎被称为“鼻鼽”，中医学认为鼻鼽主要是由于肺气虚寒，肺卫不固，外邪趁虚而入，鼻为肺之外窍，外邪侵犯，首当其冲，肺气失宣，鼻窍气机不畅，津液停聚，以致患者发生鼻塞、鼻痒、流清涕等临床症状。现代研究表明，中医治疗变应性鼻炎主要是通过运用抗过敏作用的中药以及通过调节脏腑气血阴阳运行平衡，改善机体内环境来提高机体抵抗外界过敏原的免疫功能。益气温阳方中麻黄宣肺平喘利水，桂枝解表散寒、温肺化饮，二者相伍增强通阳宣散解表之力，大量药理学研究表明，两者都具有很好抗炎抗过敏的作用[5-6]；干姜味辛，大热，温中散寒、温肺化饮；五味子、乌梅味酸，都具有敛肺止咳之效，现代药理学表明，五味子和乌梅[7-8]都具有免疫调节作用，可以提高机体的免疫力；黄芪益气固表、补养气血，对机体体液免疫和细胞免疫都有很好的促进作用[9]；党参健脾益气、补气养血，对机体的免疫系统有很强的增强作用[10]；辛夷祛风散寒、通鼻窍，具有抗过敏的功效，是治疗过敏性鼻炎的要药；地龙性寒，清热平喘，现代药理学研究发现，地龙具有抗组胺、提高免疫的作用[11]。本次实验通过研究益气温阳方引起活化后的NK1型细胞细胞因子IL-10、INF-γ以及NK2型细胞细胞因子IL-4、IL-5分泌的改变，说明本方可以抑制NK2型细胞细胞因子的释放，促进NK1型细胞因子的表达，提示益气温阳方治疗变应性鼻炎的机制可能与其抑制NK2型细胞活化，促进NK1型细胞活化有关。

西替利嗪是公认治疗AR比较有效的抗过敏药，因此本实验设置西替利嗪为阳性对照组，对比中医药的治疗效果。虽然临床上西替利嗪治疗AR效果很好，但是缺少关于西替利嗪对NK细胞调节机制的相关研究报道，本实验研究结果表明西替利嗪对活化后的NK1型细胞细胞因子IL-10有促进作用，并抑制NK2型细胞细胞因子IL-4、IL-5分泌，这为西替利嗪调控NK细胞治疗AR患者机制方面做出可能的补充，可以为后续西替利嗪对NK细胞的药理作用研究提供一些参考。

本次实验表明，益气温阳方低、中、高剂量均不同程度的抑制了活化后的NK2细胞释放IL-4、IL-5，以及促进活化后的NK细胞释放IL-10，其中益气温阳方中剂量效果最好，最大程度抑制了IL-4、IL-5的释放以及促进了IL-10的释放。综合上述指标可以看出，益气温阳方能通过影响活化后的NK细胞促炎以及免疫抑制类细胞因子的分泌和合成，有效干预变应性鼻炎的发病机制，发挥益气温阳方治疗变应性鼻炎的作用。

本次实验将中医药调节机体内环境平衡与调节活化后的NK细胞细胞因子的分泌和成相结合，探索治疗变应性鼻炎的新思路，是本实验的创新点，但还存在一些问题，如本实验研究的细胞因子较少，应该对活化后的NK细胞释放的细胞因子进行更多的研究，体外实验仍需进一步完善。随着现代科学技术的发展，笔者相信从现代科学角度阐释、理解中医宏观的哲学理念将会取得很大的进展，中医药在治疗变应性鼻炎疾病方面会有更大的进步。