一贯煎对大鼠肝星状细胞雌激素受体的影响

郭敏,刘真,张丽慧,刘雪涛,张立果,桑锋*

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学，河南 郑州 450000)

肝纤维化是一个病理学概念，是指肝组织内肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)等活化，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分过度增生与异常沉积，肝脏结构或(和)功能异常的病理变化，结构上表现为肝窦毛细血管化、汇管区与肝小叶内纤维化；功能上可以表现为肝功能减退、门静脉高压等，是所有肝脏疾病末期并发症的基础，最终结局是形成肝硬化，甚至肝癌。流行病学研究发现,在人群中除了原发性胆汁性肝硬化外，肝纤维化男女发病率之比为2.3∶1～2.6∶1[1-2],但绝经后女性的发病率要高于相同年龄阶段的男性。研究发现,雌激素在肝硬化进展中可以起到保护作用[3],主要通过肝星状细胞表面的雌激素受体及其介导的相关信号通路，抑制肝星状细胞活化，从而发挥抗肝纤维作用，因此雌激素受体调节剂作为抗肝纤维化的新靶点具有广泛的应用前景。基于一贯煎具有显著影响雌激素水平的作用，及其在抗肝纤维化治疗的广泛应用，本课题拟从对HSC雌激素受体影响方面进一步探讨一贯煎抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

SPF级健康雌性SD大鼠25只，体质量(200±20)g，购自郑州大学实验动物中心，合格证号：SCXK(豫)2015-0004。大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞由河北医科大学第二附属医院惠赠。本动物实验经河南中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会审核批准，符合实验动物伦理委员会的要求。

1.2 药物与试剂

一贯煎组成：沙参10 g，麦冬10 g，当归10 g，生地黄30 g，枸杞子15 g，川楝子5 g，由四川新绿色药业提供。雌二醇由中国药检所提供，使用前溶于DMSO备用。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原ELISA试剂盒(博士德生物，EK0412)；ERα及ERβ引物(上海生工公司合成)；反转录试剂盒(南京Vazyme)；荧光定量PCR试剂盒( 南京Vazyme)；Trizol(Ambion，15596-026)。

1.3 仪器

显微镜LEICADM4000；电热恒温培养箱(日本ASONE，ICV-450)；全自动酶标仪(Thermo scientific，MultiskanMK3)；电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C)；酶标仪(Thermo，mμlISKANMK3)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂，DYCZ-24DN)；实时荧光定量PCR仪(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，Nano-100)；紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司，JY02S)。

1.4 含药血清制备

药物血清制备参照徐叔云主编的《药理实验方法学》相关内容。SPF级健康雌性SD大鼠常规饲养，使用标准颗粒饲料，自由进食水。分为5组，每组5只，按体表面积算出每只大鼠所需药物(大鼠等效剂量为人体的6.3倍)，一贯煎提取物经纯净水溶解后按高、中、低3个剂量(4.1、8.4、16.8 g/kg)灌胃；空白组：给与同等量的纯净水灌胃；阳性组：雌二醇(0.1 mg/kg)灌胃。每天早上8点、晚上8点各给药1次,共7天，在末次给药后1 h腹主动脉取血,4 ℃静置2 h，3 000 r/min,离心15 min,取血清,分离的血清同组混匀，经恒温水浴56 ℃ 30 min灭活补体，在超净台用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌分装，放入-70 ℃冰箱中保存备用。

1.5 HSC-T6细胞培养及分组

HSC-T6细胞用含有10%热灭活胎牛血清的DMEM完全培养基在37 ℃、5%CO2、完全饱和湿度条件下CO2培养箱培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。细胞生长铺满培养瓶底80%后，用胰蛋白酶消化传代，将处于对数生长期的HSC-LX2细胞以一定密度(5×105/mL)在24孔板中接种。分别为空白组(加入空白组鼠血清)、雌二醇血清组、一贯煎高剂量血清组、一贯煎中剂量血清组和一贯煎低剂量血清组共5组，血清添加量为10%，每组设8个复孔，培养24 h、48 h、72 h后，分别收集细胞和上清液，保存备用。

1.6 MTT法测细胞增殖

细胞培养24 h、48 h、72 h后，消化、分离，以一定密度(5×105/mL)于24孔板中接种，每孔100 μL。加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养4 h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL/孔，震摇溶解10 min后，用酶标仪测定490 nm的光吸收度(OD)值。

1.7 ELISA法测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达

培养48 h后以1 700 r/min离心5 min，收集上清液。参照试剂盒说明用酶标仪检测450 nm处OD值。通过标准曲线计算各组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原浓度。

1.8 Real time-PCR法检测ERα、ERβ mRNA表达

分组培养48 h后，收集细胞，冰PBS液漂洗3次，加入Trizol提取细胞总RNA并检测其浓度和纯度，-80 ℃冰箱保存。逆转录反应：参照反转录试剂盒说明书配置反转录体系，反应终体积 20 μL，42 ℃反应30 min，85 ℃反应5 min，反应产物-20 ℃保存。引物设计 利用NCBI在线引物设计工具设计ERα、ERβ及内参GAPDH的引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH序列：上游AACGACCCCTTCATT,GACCT下游CCCCATTTGATGTTAGCGGG，产物长度164 kb；ERα：上游ACACCATCGATAAGAACCGG，下游TTCGGCCTTCCAAGTCATCT，产物长度153 kb；ERβ上游ATCTGTCCAGCCACGAATCA，下游CCGTTTCTCTTGGCTTTGCT，产物长度197 kb。实时荧光定量PCR反应 以反转录获得的 cDNA 为模板，参照VazymeAceQ qPCR SYBR®Green Master Mix试剂盒说明书配制反应体系，35～40个循环，根据扩增曲线和溶解曲线，利用2-△△Ct法进行统计处理。采用比较2-△△Ct法分析ERα、ERβ mRNA的相对表达量。以GAPDH作为内参基因计算各组△Ct值(即Ct目的基因-Ct内参基因)，组间比较得到△△Ct 值(即两组△Ct值相减)，通过2-△△Ct值分析组间比较目的基因的变化：2-△△Ct≥2，组间比较目的基因表达明显增高；2-△△Ct≤0.5，组间比较目的基因表达明显降低。

1.9 统计学方法

应用SPSS19.0 For Windows统计软件包，所有数据均以均数±标准差表示。计量资料采用方差分析，计数资料采用秩和检验。若P≤0.05则表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一贯煎对HSC-T6细胞增殖的影响

与空白组比较，作用24 h后，雌二醇组及一贯煎高剂量组表现出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05)；作用48 h后，雌二醇组、一贯煎各剂量组均表现出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且两组之间差异无统计学意义(P>0.05)；作用72 h后，一贯煎高剂量组的抑制增殖作用优于雌二醇组(P<0.05)。 见表1。

表1 一贯煎对HSC-T6细胞增殖的影响

注：与空白组比较，△P<0.05；与雌二醇组比较，*P<0.05。

2.2 一贯煎对HSC-T6细胞上清液Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的影响

培养48 h后，与空白组比较，一贯煎各剂量组均能降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的含量(P<0.05)；与雌二醇组比较，一贯煎高、中剂量组的Ⅰ型胶原含量差异无统计学意义(P>0.05)；但在降低Ⅲ型胶原含量方面，一贯煎高剂量组呈现明显的优势(P<0.05)。见表2。

表2 HSC-T6细胞上清液中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的含量比较

注：与空白组比较，△P<0.05;与雌二醇组比较，*P<0.05。

2.3 一贯煎对HSC-T6细胞ERα、ERβ mRNA表达的影响

HSC-T6细胞加入各含药血清培养48 h后，提取总RNA，进行RT-PCR。与空白组相比，雌二醇组、一贯煎高剂量、中剂量及低剂量组均可明显提高ERα、ERβ mRNA表达(P<0.05)；一贯煎各剂量组较雌二醇组ERα、ERβ mRNA表达降低(P<0.05)。见表3。

表3 一贯煎对HSC-T6细胞ERα、ERβ mRNA表达的影响

注：与空白组比较，△P<0.05；与一贯煎低剂量组比较，▲P<0.05；与一贯煎高剂量组比较，*P<0.05。

3 讨论

HSC是肝细胞和窦内皮细胞之间的内皮下间隙非游走的窦旁细胞，在慢性肝损伤过程中，HSC受到各种刺激后活化，活化后的HSC表现出难以逆转的高增殖性、高分泌性和永生性特征，分泌大量的细胞外基质(主要为Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原)，是肝纤维化发生的关键环节。因此抑制HSC活化，可有效地减轻或逆转肝纤维化[6]。

雌激素受体(estrogen receptor,ER)是一种糖蛋白，属于甾体激素受体超家族成员，主要有ERα和ERβ两种亚型，在心肌纤维化、肾间质纤维化、肺纤维化等纤维化疾病中，雌激素通过与ER结合，激活雌激素应答元件(estrogen responsive element，ERE)基因的表达，不同程度的发挥抗纤维化和保护器官功能的作用。研究发现[4-5],接受雌激素替代治疗的绝经女性发生肝纤维化的几率比未接受治疗的绝经女性要低。动物实验也证实雌二醇具有抗肝纤维化作用可能与通过抑制TGF-β/NF-κB信号通路、抑制肝星状细胞活性有关[6-9]；ERβ激动剂可改善四氯化碳诱导的肝硬化的发生[10]。雷洛昔芬(雌激素受体调节剂)可能通过调节HSC表面的ERα改善高脂饮食诱导的卵巢切除雌性大鼠的肝纤维化[11-12]。林柳兵等发现，具有ER调节剂作用的柴胡皂苷d可提高肝星状细胞ERα和ERβ mRNA的表达，抑制肝星状细胞的活化[13-15]。因此，有效调节HSC的ER有利于延缓肝纤维化进展。

肝纤维化可归为“癥积”范畴，历代医家对肝纤维化的病因病机有不同的观点。性激素可归属于“肾精”范畴，绝经后女性生理特性为“肾气虚，天癸竭”，其发生肝纤维化被认为是肝肾同病。明代秦景明在《症因脉治》中明确提出“乙癸同源，肝肾同治”，这一治疗原则在李中梓《医宗必读》“东方之木，无虚不可补，补肾即所以补肝；北方之水，无实不可泻，泻肝即所以泻肾”中得到透彻地阐发。“肝肾同治”基本治则为 “滋水涵木”。通过“滋水涵木”以维持“肾精-肝血”相生、“闭藏-疏泄”统一和“生发-涵养”协调[14]。因此基于“肝肾同源”理论，从肾调治，以协调肝主生发与肾主涵养的调控体系，在绝经后女性肝纤维化治疗中应用补益肝肾药物，可提高临床疗效。

“一贯煎”是肝肾同治的代表方，出自清代名医魏玉璜的《续名医类案》，由生地黄、沙参、枸杞、麦冬、当归、川楝子等6味药组成，该方有滋养肝肾、疏肝理气之功。本方用一味疏肝药川楝子以调肝木之横逆，配入大量养阴药之中，寓疏于补，肝肾同治，是滋阴养肝，疏肝开郁的常用方,既符合肝肾同源的医理，又暗含滋水涵木的契机,魏玉璜认为一贯煎“可通治吞酸疝瘕一切肝病”。

有研究表明,一贯煎为主的复方可改变卵巢早衰大鼠卵巢和垂体形态,并可恢复卵巢周期性功能[16]。亦有研究也表明,一贯煎加减方能减轻肝肾阴虚型围绝经期综合征妇女的更年期症状，且可升高血清中雌激素水平[17]。一贯煎具有明确的抗肝纤维化作用，有学者发现一贯煎可以抑制肝星状细胞活化、抑制胶原的合成，促进过度增生的胶原纤维的降解，抑制四氯化碳诱导的肝硬化的形成[18]。一贯煎拮抗四氯化碳诱导的肝纤维化的机制，可能与调节肝组织内基质金属蛋白酶-1的含量，促进胶原纤维降解有关[19]。研究也发现阿德福韦酯片加用一贯煎后，可显著改善乙肝肝硬化患者的中医症状及肝脏纤维化程度[20-21]。

本研究从雌激素受体角度，观察在“肝肾同源”理论指导下的一贯煎对肝星状细胞增殖及胶原含量的影响，进一步探讨一贯煎在改善绝经后女性肝纤维化的作用机制。从细胞学角度提示，一贯煎含药血清能够抑制HSC-T6细胞增殖，降低细胞上清液中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量，提高HSC-T6细胞ERα、ERβ mRNA的表达。此结果表明,一贯煎抑制肝星状细胞增殖的作用靶点之一可能为肝星状细胞的雌激素受体，同时也为一贯煎抗肝纤维化的“肝肾同治”提供了实验依据。