大马士革Ⅲ玫瑰嫩枝扦插及其生根机制初步研究

漆冬梅胡进耀

(1.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川 绵阳 621000；2.绵阳师范学院森林与草原防灾减灾工程研究中心，四川 绵阳 621000；3.绵阳市农业科学研究院中药材研究所，四川 绵阳 621000)

大马士革玫瑰(RosadamasceneMiller)属蔷薇科、蔷薇属的植物，所产玫瑰精油纯正、香气浓郁、质量稳定, 符合ISO 9842国际质量标准，是世界上最好的玫瑰精油生产品种之一，精油价格高于黄金数倍，被誉为“液体黄金”，在化妆品、食品、药品及保健品等领域具有广泛用途[1-2]。大马士革Ⅲ玫瑰(Rosadamascenetyigintipetala)是从大马士革玫瑰中分离、筛选所得优良专用油用玫瑰品种，既具有大马士革玫瑰的优点，同时又具有抗病力强，适应性广，产花量和出油率高的特点，广泛用于栽培生产[3-4]。

大马士革Ⅲ玫瑰无种子进行实生繁殖，采用压条和嫁接繁殖速度较慢，繁殖系数低，与国内另外2个主要油用玫瑰栽培品种紫枝玫瑰(Rosarugosa)和苦水玫瑰(Rosastertata×Rosarugosa)相比，扦插生根成活较难。在产业化发展进程中，优良种苗本地化供应不足，导致现有的栽培面积远远不能满足市场的需求，已成为当前制约大马士革Ⅲ玫瑰产业化发展的瓶颈问题。嫩枝扦插穗条比较幼嫩，内源生长促进物质较多，抑制物质较少，细胞分生能力强，较硬枝扦插生根容易且迅速，同时与压条、嫁接等相比，它具有简单易行、不受植物种类限制、繁殖速度快、系数高、成本低的优点[5]。随着植物生长素的运用，对插穗生根机理的认识，以及人工智能温室大棚的应用和推广，嫩枝扦插在许多难生根树种的扦插繁殖中获得很大成功[6-8]。研究还表明，POD、PPO和IAAO在植物的生长发育中起重要作用，在植物不定根形成期间呈现一定规律性变化，与不定根的发生和发展有着密切的关系[9-11]。

由此，本研究采用正交试验研究植物生长素种类、浓度、浸泡时间和扦插基质4个因素对大马士革Ⅲ玫瑰嫩枝扦插育苗的影响，筛选提高扦插生根效果的适宜方法。同时，测定不同处理生根过程中3种氧化酶POD、PPO和IAAO活性动态变化，揭示大马士革Ⅲ玫瑰嫩枝扦插生根机理，以期为大马士革Ⅲ玫瑰种苗批量化繁育和产业化推广提供科学理论依据和源头技术保障。

1 材料与方法

1.1 插穗的采集与扦插条件

试验于2016年9月上旬在绵阳宏林玫瑰开发有限公司示范基地温室大棚内进行，选取定植3年以上的优良大马士革Ⅲ玫瑰植株为母树，剪取当年或次年生、健壮整齐、节间匀称、无病虫害、半木质化枝条的中上部位为插穗。插穗长10 cm左右，2～4个饱满芽，上切口平剪，切口距最上一芽1～2 cm，下部紧靠节下剪成45°斜面，保留上部复叶2～3片，每片复叶留2～4个小叶。插穗采集宜选在阴天早晨进行，剪后枝条放在0.2%多菌灵溶液中浸泡消毒，然后按正交试验中不同的生长素种类、浓度和浸泡时间做处理。

将基质的各种组合配置好，选择晴天暴晒1 d，在使用前1 d用800倍多菌灵溶液消毒灭菌，处理后的插条及时插入扦插池内，扦插深度2～3 cm，大棚遮光率为70%左右，相对湿度控制在60%～90%，温度控制在20～30 ℃，生根后逐渐减少喷雾次数，并每隔1周喷施0.2% KH2PO4+0.5%尿素溶液，以促进扦插苗根的生长。

1.2 试验设计

正交试验设计见表1，试验设4个因素(A生长素；B浓度；C浸泡时间；D基质类型)，3个水平。每处理500条插穗，其中400株用于生根进程观察和酶活性测定，100株用于全面生根指标调查，完全随机区组排列3次重复。

1.3 指标及测定方法

1.3.1生根指标的测定

扦插后每隔5 d进行1次生根形态观察，于40 d进行全面调查生根类型、愈伤组织形成期、生根期、生根率、生根数、根长和生根指数。每处理各重复选具有代表性的100株统计根数和根长，取平均值进行分析。以生根指数作为综合生根效果的评价指标，计算方法参照牟洪香等[12]的测定方法，生根指数=生根率×平均根数×平均根长。其意义是指单株扦插苗的平均总根长(cm)。以生根率对生根指数贡献最大，平均根数次之，平均根长最次。

单一或少数指标难以全面、客观地反映各因素水平组合的扦插生根效果，本研究拟同时采用隶属函数法对各处理的育苗效果进行综合评价。隶属函数计算公式为：

U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：Xj为指标测定值，Xmin与Xmax为所有处理某一指标的最小值和最大值；将各处理不同指标的隶属值进行累加求其平均值，平均值越大生根效果越好[13]。

1.3.2酶活性的测定

取处理1(100 mg·L-1ABT 1浸泡2 h，珍珠岩为扦插基质)、处理9(400 mg·L-1IBA浸泡4 h，珍珠岩为扦插基质)和空白对照ck(清水快速浸泡，直接扦插于珍珠岩中，其它管理水平相同)的插穗，用蒸馏水洗净、吸水纸擦干后剥取插穗基部2 cm范围内皮层，剪碎、混合均匀并液氮固定，-80 ℃保存，用于氧化酶活性测定。每5 d采样1次，每个指标均在3个区组各随机取5株，进行3次重复测定，测定到第40天。POD活性和IAAO活性测定参照张志良等[14]的方法，PPO活性测定参照李焕秀等[15]的方法。其中POD活性以每克鲜质量每分钟改变1个OD值为1个酶活性单位[U·(g·min)-1]；PPO活性以每克鲜质量每分钟光密度每变化0.01为一个酶活性单位[U·(g·min)-1]；IAAO活性以每克鲜质量在1 h内分解破坏IAA的μg数表示一个酶活性单位[U·(g·h)-1]。

1.4 数据处理

采用DPS 7.05软件进行正交试验方差分析、LSD多重比较、极差分析，以及不同处理和同一处理不同时间点氧化酶活性方差分析。采用Excel 2016进行隶属函数评价分析和图表绘制。

表1 L9(34)正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 生根类型情况观察

大马士革Ⅲ玫瑰扦插15 d左右愈伤组织大量形成，愈伤组织较薄，呈痂状(见图1)。20 d左右插穗开始生根，不定根原基发端于切口处靠近愈伤组织的地方为主，兼有皮部生根，属混合生根类型，30 d以后不定根系不断伸长(见图2)。因此，由实验观察结果可知，插穗扦插后0～15 d为插穗愈伤组织诱导期，15～30 d为不定根形成期，30 d后为不定根伸长期。正交实验结果见表2。不同处理对大马士革Ⅲ玫瑰插穗愈伤组织形成期和生根期均有一定影响，各处理愈伤组织形成期和生根期相差5 d左右。各处理生根条数8～13条，根长3.23～4.47 cm，生根率46%～92%，生根指数14.59～51.61。移栽大田前假植苗情况见图3。

图2 扦插苗长势及生根情况

表2 正交实验结果

注：表中数据为3次重复平均值。

图1 愈伤组织的形成

2.2 不同因素对大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根指标的影响

选取生根率、生根数、根长和生根指数作为评价大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根效果的4个指标，对扦插结果进行方差分析和LSD多重比较，见表3和表4。

2.2.1生长素种类对生根的影响

由表3可知，不同生长素处理之间生根率、根长和生根指数差异分别达到极显著、显著和极显著水平，生根数差异不显著。由表4可知，IBA处理生根率最高(1.02)，ABT 1处理生根率次之(0.97)，两处理生根率在0.05和0.01水平下均无显著差异，但都极显著高于NAA处理生根率0.79；IBA处理根长最长(4.11 cm)，ABT 1处理根长次之(4.02 cm)，两处理根长在0.05和0.01水平下均无显著差异，但都显著高于NAA处理根长3.52 cm；IBA处理生根指数最高(32.63)，ABT 1处理生根指数次之31.20，两处理生根指数在0.05和0.01水平下均无显著差异，但都极显著高于NAA处理生根指数16.24。

表3 正交实验方差分析

注：“*”表示显著(α=0.05)，“**”表示极显著(α=0.01)；生根率数据开平方后取反正炫，再进行方差分析。

图3 移栽大田前的假植苗

2.2.2生长素浓度对生根的影响

不同生长素浓度间生根数和生根指数差异均达极显著水平，生根率和根长差异不显著。100 mg·L-1和200 mg·L-1的处理生根数最高，均为11.67，两处理生根数在0.05和0.01水平下均无显著差异，但都极显著高于400 mg·L-1处理生根数8.33；100 mg·L-1的处理生根指数(31.98)最高，200 mg·L-1的处理生根指数(28.55)次之，两处理生根指数在0.05和0.01水平下均无显著差异，但都极显著高于400 mg·L-1处理生根指数19.54。不同生长素浓度间生根率和根长虽然无显著差异，但均表现出随着浓度的增加，2个指标值呈逐步下降的趋势。

2.2.3浸泡时间对生根的影响

不同浸泡时间之间生根率差异极显著，生根指数差异显著，生根数和根长差异不显著。2 h处理生根率最高(1.04)，4 h处理生根率次之(0.92)，6 h处理生根率最低(0.82)，3个浸泡时间处理生根率两两之间差异均达到极显著水平，并且随着处理时间的增加，生根率呈下降趋势；4 h处理生根指数(25.63)和6 h处理生根指数(0.82)较低，两处理生根指数之间差异不显著，但都显著低于2 h处理生根指数(31.15)。随着处理时间的增加，生根指数呈逐步下降的趋势。

表4 各试验因素对扦插生根指标影响及LSD多重比较

注：α=0.05水平下，相同小写字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著；α=0.01水平下，相同大写字母表示差异不显著，不同大写字母表示差异极显著。下同。

2.2.4扦插基质对生根的影响

不同扦插基质间生根率和生根指数差异极显著，生根数和根长差异不显著。珍珠岩扦插生根率最高(1.11)，草炭扦插生根率次之(0.87)，珍珠岩+草炭(1∶1)扦插生根率最低(0.81)，三类基质处理生根率两两之间均在0.05水平下差异显著。在0.01水平下，草炭与珍珠岩+草炭(1∶1)处理间生根率差异不显著，但都极显著低于珍珠岩处理生根率；珍珠岩处理生根指数最高(37.3)，草炭次之(23.92)，珍珠岩+草炭(1∶1)处理(18.84)最低。草炭处理与珍珠岩+草炭(1∶1)处理之间在0.05和0.01水平下均无显著差异，但都极显著低于珍珠岩处理生根指数(37.3)。

表5 各试验因素对生根指标影响的极差分析

注：表中1、2、3分别表示各因素相应的水平，具体数值见表1。

表6 不同因素组合对大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗指标的影响及隶属函数评价

2.2.5生根效果综合分析

4个因素中，扦插基质对生根率影响最大，其次依次为生长素种类、浸泡时间和生长素浓度。对生根指数影响由大到小的因素依次为扦插基质、生长素种类、生长素浓度和浸泡时间。综合生根率、根长、生根数和生根指数4个指标，处理1(ABT 1、100 mg·L-1浓度、浸泡2 h、珍珠岩为扦插基质)对提高大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根效果最佳。

2.3 生根效果极差分析

由表5可知，仅以生根率为主要考虑因素，影响扦插生根的主要因子为扦插基质(R=0.30),其次依次为生长素种类(R=0.24)、浸泡时间(R=0.22)和生长素浓度(R=0.05)，理论优组合为A3B1C1D1；仅以根长为主要考虑因素，影响扦插生根的主要因子为生长素种类(R=0.59)，其次依次为扦插基质(R=0.48)、浸泡时间(R=0.43)和生长素浓度(R=0.27)，理论优组合为A3B1C2D1；仅以生根数为主要考虑因素，影响扦插生根的主要因子为生长素浓度(R=0.43)，其次依次为生长素种类(R=1.89)、扦插基质(R=1.44)和浸泡时间(R=0.44)，理论优组合为A1B1C3D1；仅以生根指数为主要考虑因素，影响扦插生根的主要因子为扦插基质(R=18.46),其次依次为生长素种类(R=16.39)、生长素浓度(R=12.43)和浸泡时间(R=7.87)，理论优组合为A3B1C1D1；对生根率和生根指数2个重要生根指标的理论优组合一致，均为A3B1C1D1,以上3个理论优组合在实验处理中均不存在，这些组合的作用效果是否受因素水平间交互作用影响，尚需进一步的试验验证。

2.4 不同处理对大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗指标的影响及隶属函数评价

由表6可知，4个生根指标在9处理组合中均存在显著差异，同一处理组合，不同生根指标优劣表现也不尽相同，单一或少数指标难以全面、客观地反映各因素水平组合的扦插生根效果，故采用隶属函数法对各处理的育苗效果进行综合评价。由隶属函数法综合评价结果(见表6)可知，处理1(100 mg·L-1的ABT 1，浸泡2 h，珍珠岩)的隶属函数值最大(0.97)，其生根率(1.29)、生根数(13.0)和生根指数(51.57)均在9个处理组合中最大，仅根长在9个处理组合中位列第2，为本实验最佳扦插处理。处理9(400 mg·L-1的IBA，浸泡4 h,珍珠岩)的隶属函数值(0.88)排第2，其根长(4.5)在9个处理组合中最大，生根率1.18、生根数12.67和生根指数44.05在9个处理组合中均位列第2。由此，处理1为大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗生根的最优组合，处理9为次优组合。

2.5 相关氧化酶活性变化

由隶属函数评价分析结果可知，处理1和处理9为大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗生根的最优组合和次优组合。为了探索其内在相关氧化酶活性变化，本实验还对处理1(使用ABT 1生长素处理)、处理9(使用IBA生长素处理)和空白对照ck(清水快速浸泡，直接扦插于珍珠岩中，其它管理水平相同)在扦插生根过程中插穗基部3种氧化酶PPO、POD和IAAO活性的动态变化进行了研究。

2.5.1POD活性变化

本研究3个处理POD活性在插穗生根的不同时期均呈现一定规律性变化(见图4)。处理1与处理9插穗皮层中POD活性在愈伤组织诱导期(0～15 d)内上升，不定根形成前期(15～25 d)下降，不定根形成后期(25～30 d)内继续上升，30 d后进入不定根伸长期，POD活性又开始下降，在第15天和第30天其活性各有一个明显的峰值，属双峰型变化曲线。对照各时期POD活性值变化趋势相对平缓，第一峰值出现在20 d,相对处理1和处理9更晚，但曲线总体变化趋势与处理1和处理9大致相同。方差分析表明，处理1和处理9 POD活性值均极显著的高于对照(F=19.64,p<0.01),处理1不同生根天数之间、处理9不同生根天数之间POD活性值差异均达到极显著水平(F=1 367.96,p<0.01；F=1 345.78,p<0.01)。

图4 大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根过程中POD活性变化

2.5.2PPO活性变化

3个处理PPO活性在插穗生根的不同时期变化曲线见图5。由图5可知，处理1和处理9插穗PPO活性变化趋势大致相同，在愈伤组织诱导期(前15 d内)持续上升，15 d以后进入不定根形成期和伸长期，PPO活性逐步降低，但始终高于扦插初期。对照POD活性值曲线变化趋势相对平缓，在第20天出现一个不明显峰值，后期PPO活性也逐步降低。方差分析表明，处理1和处理9 PPO活性值均极显著的高于对照(F=30.17,p<0.01)，处理1不同生根天数之间、处理9不同生根天数之间PPO活性值差异均达到极显著水平(F=524.73,p<0.01；F=493.10,p<0.01)。

图5 大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根过程中PPO活性变化

2.5.3IAAO活性变化

3个处理IAAO活性在插穗生根的不同时期变化曲线见图6。由图6可知，处理1插穗内IAAO活性在前30 d内逐步上升，并在30 d达到峰值，30 d以后进入不定根伸长期，活性逐步下降。处理9插穗IAAO活性变化趋势与处理1大致相同，但在25 d活性达到峰值，此后进入不定根形成期后期和伸长期，IAAO活性逐步下降。对照IAAO活性曲线变化趋势与处理9类似。方差分析表明，处理1和处理9 IAAO活性值均极显著的低于对照(F=30.17,p<0.01)，处理1不同生根天数之间、处理9不同生根天数之间IAAO活性值差异均达到极显著水平(F=79.54,p<0.01；F=669.26,p<0.01)。

图6 大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根过程中IAAO活性变化

3 讨 论

扦插作为常规无性繁殖技术具有简单、快速、高效、高质量繁殖苗木和可完整的保持亲本植株的优良遗传特性等优点[13]，但植物扦插生根是一个复杂的生理生化过程,影响的因素较多，除了与植物自身遗传特性相关外，还与处理插穗的生长素种类、生长素浓度、浸泡时间及扦插基质等诸多外界因素密切相关[16-19]。本研究表明，大马士革Ⅲ玫瑰插穗主要为愈伤组织生根型，兼有少量皮部生根类型，与赵蓓蓓等的研究结果一致，说明同属不同栽培种间插穗的成根生理基础接近[5]。生长素种类、生长素浓度、浸泡时间和扦插基质，对愈伤组织形成期、生根期、生根率、生根数、根长和生根指数等生根指标存在不同程度的影响。

3.1 生长素种类和浓度、浸泡时间及扦插基质对大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根的影响

外源生长素通过影响插穗内部养分的调配，提高插穗生根区的内源生长素水平和IAA氧化酶、过氧化酶活性，加速淀粉、蛋白质水解和糖代谢，调节愈伤组织的形态建成，从而促进根原基形成与生长，促进插穗发根[17,20-22]。本研究通过方差分析得到，生长素种类对生根率和生根指数影响显著，ABT 1处理的生根率和生根指数最高。生长素浓度对生根数和生根指数影响显著,最低浓度水平100 mg·L-1处理生根数和生根指数最高，表现出“低促高抑”效应。浸泡时间对生根率和生根指数影响显著，最短浸泡是2 h处理的生根率和生根指数最高，同样也表现出“低促高抑”效应。由极差分析可知，影响生根率、根长、根数和生根指数的因素主次关系及理论优组合不尽相同。影响生根率和生根指数的理论优组合一致，均为A3B1C1D1(生长素IBA，100 mg·L-1，浸泡2 h，珍珠岩作为扦插基质)，该组合在正交试验处理中不存在。而正交试验方差分析和隶属函数评价筛选出的大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗的最佳处理组合均为处理1(100 mg·L-1的ABT 1，浸泡2 h,以珍珠岩为扦插基质)。可以看出以上2个组合均为采用最低浓度水平的生长素，最短浸泡时间,更有利于提高大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗效果，与本研究方差分析结果和Laubscher等[19]的研究结果一致。不同之处在于分别选择了IBA和ABT 1作为生长素，而多重比较的结果可知，IBA和ABT 1两类生长素处理对4个生根指标的影响均无显著差异。至于A3B1C1D1处理组合在具体实施中是否受因素水平间交互作用影响，作用效果是否优于处理1，尚需进一步的试验验证。

基质的组成与理化性状决定着生根环境，理想的扦插基质应具有良好的透气性[23-24]、保水性和养分储备能力[25-26]，以及良好的气-水平衡更有利于促进不定根形成，增强根系活力[16,24,27]。本研究得出纯珍珠岩基质处理的生根率和生根指数都极显著的高于另外2种扦插基质，为大马士革Ⅲ玫瑰扦插育苗最佳基质，推测是因为珍珠岩质量轻、间隙大，保证了定期的水、温、肥管理后，能同时满足上述理想基质的条件，非常有利于穿透生根，而且移栽也方便。

3.2 相关氧化酶在大马士革Ⅲ玫瑰扦插过程中活性变化

处理1和处理9中3种氧化酶POD、PPO和IAAO活性与空白对照差异极显著，表明使用ABT 1和IBA后改变了植物体内3种氧化酶活性。在生根过程的不同天数，处理1和处理9三种氧化酶活性差异极显著，表明大马士革Ⅲ玫瑰的不定根发生和发展与三类酶活性有密切联系。

POD与植物离体生根关系密切，是植物生根标志性物质之一[10]。本研究中处理1和处理9 POD活性在扦插后15 d和30 d均出现2个明显峰值，与前人对其他植物的研究一致[8,11,28]。其活性在愈伤组织诱导期和不定根伸长期内持续升高，是插穗具有生根能力的标志[29-30]。POD能氧化植物体内IAA，消除过多的内源IAA，更有利于根原基的诱导和不定根的形成[8,11]。处理1和处理9 POD活性值在生根过程中均极显著的高于对照，说明2处理均有效提高了插穗内源POD活性，提高了扦插生根效果。

许多植物插穗中含有大量的酚类化合物，是抑制扦插生根的主要内源物质之一[31]，而PPO的一个重要生理功能就是催化酚类物质和IAA形成一种“IAA-酚酸复合物”[9]，这种复合物是一种生根的辅助因子，能够促进不定根形成[32]，PPO还能催化生长素的代谢，促进不定根的发生与发育[10]。本研究中处理1和处理9插穗PPO活性在愈伤组织诱导期内持续上升，导致植物体内生产更多的“IAA-酚酸复合物”，促进了不定根的形成，进入不定根形成期和伸长期，PPO活性逐步降低，但始终高于扦插初期，促进了不定根的继续生长。并且两处理PPO活性值在整个生根过程中均极显著高于对照，说明两处理均有效提高了插穗内源PPO活性。这与先前的相关研究结果一致[8,11]。

IAAO是氧化IAA的专一性酶，因此插穗内的IAAO酶活性，能调节插穗内源生长素IAA水平，而IAA的尤为重要的生理功能就是促进插穗不定根的形成[11]。本实验结果处理1和处理9插穗IAAO活性在愈伤组织形成和不定根形成期内持续上升，使插穗内IAA水平降低，符合低IAA水平有利于生根的观点[11,33-34]，进入不定根伸长期后IAAO活性逐步下降，使得插穗内源IAA水平升高，高含量的IAA能促进根的生长[10,28]。两处理PPO活性值在整个扦插期内始终极显著低于对照水平。

4 结 论

大马士革Ⅲ玫瑰属皮部生根类型，常规方式扦插生根率低。本研究采用L9(34)正交试验筛选出最佳扦插育苗因素组合(100 mg·L-1的ABT 1，浸泡2 h，以珍珠岩为扦插基质)，可使扦插生根率达到92%，有效解决了该品种扦插生根较难的实际问题。

外源生长素处理改变了大马士革Ⅲ玫瑰插穗生根过程中3种主要氧化酶POD、PPO和IAAO活性水平及相互关系，在生根过程中均呈现一定的规律性变化，与不定根发生和发展密切相关。它们在生根过程中的作用可能是既独立又联系，进而影响插穗生根效果。

植物插穗生根过程的机制较为复杂，影响大马士革Ⅲ玫瑰插穗生根的生理生化因素也是多方面的。后续研究将围绕转录组和蛋白组等分子生物学方法揭示大马士革Ⅲ玫瑰扦插生根发育的分子生物学机制展开，以期进一步揭示其扦插育苗的生根机理。