云南稻核心种质籼稻SSR标记鉴定

卢玲梅

摘要    水稻核心种质是水稻遗传育种和解析复杂性状的重要基础。本研究以231份表型性状鉴定为籼稻的核心种质、典型籼稻滇屯502和典型粳稻合系35为试验材料，利用能鉴定籼粳稻的10个SSR分子标记进行籼粳鉴定，并与利用表型鉴定籼粳稻方法进行比较。结果表明，SSR聚类分析把供试材料大致分为2个大类群、4个亚群，供试品种间的遗传相似系数变化范围在0.35～1.00之间，所鉴定品种基本为籼稻品种，鉴定结果和表型性状鉴定结果基本吻合。

关键词    籼稻;核心种质;SSR标记;聚类分析;云南省

中图分类号    S511        文献标识码    A

遗传基础狭窄是近年来作物育种水平徘徊不前的主要原因之一。云南是世界稻种遗传生态多样性中心之一和中国优异种质的富集地区。目前，已开展了云南稻种初级与二级和三级核心种质的取样策略及技术体系、云南稻种资源多样性、籼粳亚种及其六大生态群、变种分类等研究，建立了云南稻种资源核心种质构建体系[1]。

由于籼稻和粳稻之间较远的遗传关系，籼、粳稻杂交往往会产生大量遗传重组和分离类型。在核心种质资源的构建中一般以品种的表型性状来划分籼、粳稻，但只用表型性状鉴定的籼粳稻往往会存在一定误差。因此，有必要发展精确、可靠、快速、简便的鉴别方法[2]。SSR标记是目前最常用的微卫星标记之一[3]。

本研究利用能区分籼、粳稻的10个SSR分子标记进行籼粳鉴定，并与利用表型鉴定籼粳稻方法进行比较研究，使云南稻核心种质籼粳鉴定更为准确，以期为有效利用种质资源和进行品种改良提供参考。

1    材料与方法

1.1    供试材料

供试水稻材料：本研究从560份核心种质中选出233份云南稻材料进行SSR分子标记，该材料来源于云南15个地区的种质资源。包括231份经表型性状鉴定为籼稻的核心种质水稻品种以及合系35和滇屯502，其中合系35为典型的粳稻品种，滇屯502为典型的籼稻品种。

供试SSR引物：选取由中国农业大学提供的10对能鉴定水稻籼粳性的SSR引物RM130、RM165、RM1240、RM5305、RM7009、RM7337、RM7479、TC04、TC66、TC130，引物序列从网站（http：//www.gramene.org）获得，由北京鼎国公司合成。

1.2    试验方法

1.2.1    DNA提取。经表型性状鉴定为籼稻的231份水稻材料以及合系35和滇屯502于幼苗期时挂牌取叶片，按CTAB法提取水稻DNA。

1.2.2    SSR反应体系建立。PCR扩增在PTC-200PCR仪上进行。PCR反应体系为10 μL，反应混合物用20 μL石蜡油覆盖，PCR结束后加2 μL双染料进行染色。

1.2.3    SSR反应程序。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环;72 ℃下最后延伸5 min，4 ℃延伸5 min，扩增产物置于4 ℃的冰箱保存。

1.2.4    扩增产物的电泳分离与检测。首先制胶，然后进行电泳，对电泳结果进行银染。

1.3    数据统计

将银染后的凝胶放到胶片观察灯下读带。每对SSR引物作为一个位点，按在同一电泳水平上，有条带的赋值为“1”，无条带的为“0”，将数据转化为1/0 矩阵，利用NTSYSpc 2.10软件处理SSR分型数据，将带型数值1/0矩阵用该软件转换成品种间相似系数矩阵，用非加权平均法UPGMA进行SAHN聚类分析，并通过NTSYSpc 2.10软件得到供试材料的遗传距离矩阵，计算品种之间的遗传相似系数并绘制树状图。

2    结果与分析

2.1    SSR引物多态性

本研究利用10对SSR引物对来源15个地区的籼稻品种进行了分析，10对SSR引物在这233份材料中共扩增出28条多态性条带，每对引物的等位基因数变幅为2～4个，平均每对引物等位基因数为2.8个。通过10对SSR引物对233份材料的扩增结果来看，10对引物中以检测出2个等位基因位点数的引物最多，4个等位基因的次之。

2.2    SSR分子标记聚类分析

用NTSYSpc 2.10软件对233份供试材料进行聚类分析，聚类分析显示，这233个品种的遗传相似系数为0.35～1.00。所有的材料大致可分为2个大类群、4个亚群。此外，根据核心种质地域来源的不同又分为了15个亚群。

以遗传相似系数为原始数据，用UPGMA法对233个材料进行聚类分析，以相似系数0.35为阈值，可将233个材料分为2个大类群，即籼稻与粳稻。以相似系数0.71为阈值，可将233个材料分为4个大类群，即籼稻、粳稻、偏籼稻、偏粳稻。在第1个类群中，68～92号的大部分品种基本与合系35聚为一类，说明68～92号品种为粳稻品种，而由来源地来看，这些品种主要来自丽江和昭通这2个冷凉地区，所以这些籼稻品种虽在表型性状上表现出了籼稻的特性，但从分子标记的结果来看，它们属于粳稻品种。因此，与表型性状鉴定相比，SSR分子标记鉴定能更准确地揭示籼粳稻之间的遗传差异。

根據10对SSR引物在233份供试材料中获得的28个等位基因可知，粳型与籼型的遗传分化系数最大，遗传相似系数仅为0.047 619 0，遗传差异最大，遗传距离最远;偏籼型与籼型的遗传分化系数最小，遗传距离最近;偏粳型与籼型、粳型与偏粳型、粳型与偏籼型的遗传分化程度居中;偏粳型与偏籼型的遗传分化程度较小。

3    结论与讨论

3.1    SSR分子标记的优势与多态性

本研究中，10对SSR引物共扩增出28条多态性条带。SSR分子标记鉴定结果与表型性状鉴定基本吻合，但SSR分子标记的鉴定更为准确，能从分子水平上鉴定水稻籼、粳的分化，比表型性状分类更为深入、细致。

3.2    SSR标记鉴定与表型性状鉴定

本试验中，各种质表型性状表现为籼，而基因型上表现为粳。表型性状可能受单基因控制也可能受多基因控制，基因之间的连锁、互作可能导致表型性状的相关与嵌合等，种种因素加上环境对表型的饰变作用，最终导致表型与基因型之间的关系错综复杂[4]。

本研究结果表明，SSR分子标记技术可以弥补表型性状鉴定水稻籼粳的分化的不足，但表型性状不能反映育种工作中所产生的选择和突变效应[5-6]。因此，单用表型性状还不能准确把握某一材料的籼粳性，且对核心种质的构建会产生一定影响，SSR分子标记可以检测到材料之间在DNA水平上的遗传差异。同时，SSR分子标记技术还可以把籼粳不清、来源不明的品种划分到相应的类群中，从而为更好地利用这些材料提供指导[7-8]。因此，通过表型性状鉴定与SSR分子标记鉴定技术相结合，则所得结果将更为完善。

4    参考文献

[1] 曾亚文，申时全，普晓英，等.云南稻种资源核心种质研究进展[J].西南农业学报，2004，17（增刊）：322-324.

[2] 樊叶杨，庄杰云，吴建利，等.应用微卫星标记鉴别水稻籼粳亚种[J].遗传，2000，22（6）：392-394.

[3] 刘炜，李自超，王坚，等.利用SSR标记对粳稻品种的遗传多样性分析[J].西南农业学报，2005，18（5）：509-513.

[4] 王兴春，朱江.水稻DNA指纹及应用[M].北京：中国农业科学技术出版社，2010.

[5] 石晗.不同类型水稻种质资源农艺性状鉴定与抗逆性筛选[D].武汉：华中农业大学，2017.

[6] 张爱民，阳文龙，方红曼，等.作物种质资源研究态势分析[J].植物遗传资源学报，2018，19（3）：377-382.

[7] 徐华山，周雷，蒋医蔚，等.部分抗病虫及品质相关基因在水稻核心种质资源中的分布[J].分子植物育种，2018，16（4）：1121-1126.

[8] 王勝军，陆作楣，万建民.采用表型和分子标记聚类研究杂交籼稻亲本的遗传多样性[J].中国水稻科学，2006，20（5）：475-480.