HPLC-MS/MS法测定人体血液中阿米替林的浓度

陈泽冠

摘 要：目的：建立血液中阿米替林的高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测方法。方法：以乙腈为沉淀剂，经蛋白质沉淀，取上清液进高效液相串联质谱系统（LC-MS/MS）分析。结论：阿米替林的标准曲线方程为Y=-0.00996052+2.83477*X（R^2=0.9998），定量下线为10ng/mL（S/N≥10：1），线性范围为10～300ng/mL。阿米替林的精密度（RSD）在0.60～1.64%之间，准确度为99.08～122.84%，在低、中、高质量浓度下，阿米替林的平均提取回收率为97.99～98.22%。该方法操作简单，灵敏度高，特异性强，可用于血液中阿米替林的定量测定。

关键词：阿米替林;血液;高效液相色谱串联质谱法

中图分类号：R115 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2020）01-0247-02

阿米替林（amitripthyline）是临床最常用的三环类抗抑郁药，能选择性地抑制中枢神经突触部位对去甲肾上腺素（NA）和5-羟色胺（5-HT）的再摄取，使突触NA和5-HT的含量增加并促进突触后膜5-HT2受体的敏感性。阿米替林经肝脏代谢，主要代谢产物为去甲替林，也有阿米替林的N-氧化物和10-羟衍生物以及去甲替林的10-羥衍生物，均有活性。

目前，国内外文献报道的有关阿米替林血浓度的测定方法较多，包括高效液相色谱法（HPLC）[1]、气相色谱/质谱联用色谱法（GC-MS）[2]、高效液相色谱/串联质谱联用法（LC-MS，LC-MS/MS）[3-5]。本文采用高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），采用蛋白沉淀方法测定血液中阿米替林浓度。

1 材料与试药

1.1 仪器

台式三重四极杆串接质谱系统（含ESI电喷雾离子源）;U3000二元超高效LC;德国赛多利斯Quintix35-1CN。

1.2 试剂

盐酸阿米替林，批号：100518-201303，纯度：99.7%，中国食品药品检定研究院;SKF525A，批号：3-SNM-27-2，纯度：99.83%，Toronto。

1.3 色谱条件

分析柱为Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm，流动相为乙腈：20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液（70∶30），流速为200μL/min。柱温为常温。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源（H-ESI）正离子选择多反应检测（SRM）扫描分析，定量分析离子对分别为：m/z278.300→m/z233.268（阿米替林）;m/z354.300→m/z209.000（SKF525A）。

2 标准溶液的制备

在空白血液中分别加入阿米替林的工作液，配置成阿米替林浓度分别为10、20、50、100、200、300ng/mL的血液标准液。

3 血液样品处理

精密量取100μL血液，加入内标50μL和沉淀剂乙腈900μL，混旋2min，10000转/min离心2.5分钟，取上清液1μL供LC-MS/MS分析。

4 方法考察

4.1 专属性

分别取6份不同来源的不服用阿米替林的正常人空白血液100μL，不加内标，按“血液样品处理”项处理，进样分析，得空白样品色谱图。另取空白血3份，1份加内标，1份加分析物，1份加内标和分析物，同法处理，得相应色谱图。

4.2 标准曲线与定量下线

含药标准曲线血液按“血液样品处理”处理后进样分析。以阿米替林添加浓度为X轴，样品与内标物的峰面积比为Y轴，进行线性回归，经“Equal”权重得阿米替林标准曲线图。

4.3 精密度、准确度和提取回收率

取24份空白血液，分别配制定量下线及低、中、高质量浓度质控样品各6份，按“血液样品处理”项处理，进样分析，连续测定3批，计算精密度和准确度。

分别配制低、中、高质量浓度的质控样品各8份，其中6份于提取前加入工作液和内标，另2份于提取后加入工作液和内标，进样分析，计算提取回收率。

4.4 稳定性

制备低、高质量浓度的血液质控样品，分别考察在常温光照放置放置24h、反复冻融3次、-70℃冻存1个月、进样器内24h条件下的稳定性。

4.5 基质效应

分别取6种不同来源的空白血清90μL，按“血液样品处理”处理，得空白基质后，分别加入低、高质量浓度工作液10μL及内标50μL，制备成基质考察样品，进样分析，得分析物与内标峰面积比值A1。用去离子水代替血液，同法操作，得分析物与内标峰面积比值A2。内标归一化的基质因子=A1/A2×100%。

5 结果

5.1 专属性

阿米替林的保留时间约为4.54min，SKF525A的保留时间约为5.70min，血液中内源性物质对目标分析物及其对应内标的测定无干扰，专属性好，见图1。

5.2 标准曲线与定量下限

阿米替林的标准曲线方程为Y=-0.00996052+2.83477* X（R^2=0.9998），定量下线为10ng/mL（S/N≥10∶1），线性范围为10～300ng/mL。

5.3 精密度、准确度和提取回收率

阿米替林的精密度（RSD）在 0.60～1.64%之间，准确度为99.08～122.84%，在低、中、高质量浓度下，阿米替林的平均提取回收率为97.99～98.22%，结果见表1。

5.4 稳定性

含药血液质控样品在常温光照下放置24h、反复冻融3次、-70℃冻存1个月、进样器内24h各条件下稳定，RSD小于15%。

5.5 基质效应

阿米替林在低和高2个质量浓度水平下的内标归一化基质因子RSD分别为1.87%、0.85%，小于15%，样品测定不受基质效应影响。

6 讨论

本实验采用LC-MS/MS建立的检测人血液中阿米替林的方法，所需血液样品量少，专属性好，灵敏度高，准确稳定。以乙腈为沉淀剂，采用蛋白沉淀法处理样品，简单快捷，可快速对样品进行定性定量分析。

参考文献

[1] 李金恒，许劲秋，曹晓梅，等.反相高效液相色谱法测定血浆中阿米替林及其代谢物去甲替林的总浓度和游离浓度[J].中国药理学通报，2001，17（1）：104.

[2] Paterson S，Cordero R，Burlinson S.Screening and semi-quantitative analysis of post mortem blood for basic drugs using gas chromatography/ion trap mass spectrometry[J].J Chromatogr B，2004，813（1）：325.

[3] Castro A，Concheiro，M，Quintela O.LC-MS/MS method for the determination of nine antidepressants and some of their main metabolites in oral fluid and plasma-Study of correlation between venlafaxine concentrations in both matrices[J].J Pharm Biomed，2008，48（1）：184.

[4] Shinozuka T，Terada M，Tanaka E.Solid-phase extraction and analysis of 20 antidepressant drugs in human plasma by LC/MS with SSI method[J].Forensic Sci Int，2006，162（1）：108.

[5] 王賢亲，吴健章，李艳霞，等.LC-MS/MS测定人血浆中阿米替林的含量[J].药物分析杂志，2009，29（11）：1846-1849.