KRAS 及其抑制剂的研究进展

李慧丽，姜飞，任继威，陆涛，陈亚东

（中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 211198）

KRAS 蛋白（kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog）是RAS 蛋白（rat sarcoma viral oncogenehomolog）家族中的重要一员，该家族的其他2 个成员分别是HRAS

蛋白（harvery rat sarcoma viral oncogenehomolog）和NRAS 蛋白（neuroblastoma rat sarcoma viral oncogenehomolog）[1]，KRAS 蛋 白 是 由KRAS基 因 编 码 的一种小GTP 水解酶（small GTPase），是细胞生存和生长的重要调节蛋白[2]。近期各大制药企业纷纷披露了KRAS 抑制剂优异的临床试验结果，使得以KRAS 为靶点的药物开发进入爆发期，吸引了广大研究者的注意。本文综述KRAS 的结构功能及其小分子抑制剂的研究进展，以期为抗肿瘤药物的开发提供参考。

1 KRAS 蛋白概述

KRAS 蛋白具有激活和失活2 种状态（见图1），当KRAS 与鸟苷三磷酸（GTP）结合时呈激活状态，而与鸟苷二磷酸（GDP）结合时呈失活状态[3]。KRAS在激活和失活状态之间的转换受鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）和GTP 酶激活蛋白（GAP）调节。GEF 催化KRAS 与GTP 结合，使KRAS 处于激活状态；而GAP 使与KRAS 结合的GTP 水解成为GDP，进而使KRAS 锁定在失活状态[4]。

KRAS 在大多情况下处于失活状态，但其可以被上游的信号因子如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）激活[5]，激活后的KRAS 可进一步激活下游的多条信号通路，如控制细胞生成的PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase，胞内磷脂酰肌醇激酶）-AKT（protein kinase B，蛋白激酶B）-mTOR（mammalian target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白）信号通路[6]，控制细胞增殖的RAS（rat sarcoma viral oncogenehomolog，大鼠肉瘤病毒同源癌基因）-RAF（rapidly accelerated fibrosarcoma，快速加速的纤维肉瘤）-MEK（mitogenactivated protein kinase，分裂原活化蛋白激酶）-ERK（extracellular regulated protein kinases，细胞外调节蛋白激酶）信号通路[7]，以及控制细胞因子释放的Ral-GEF（ras related protein-guanine nucleotide exchange factor，ras 相关蛋白鸟苷酸交换因子）信号通路[8-9]（见图2），这些信号通路在细胞生长、增殖和细胞因子释放等方面具有重要作用。

KRAS是RAS家族中最常发生突变的亚型，KRAS突变大概占RAS家族突变总数的85%，HRAS和NRAS仅发生少量突变，多为个位数占比[10]。KRAS在多种癌症中均有突变（见表1），其中胰腺癌突变率高达90%，结肠癌和肺癌（大多为非小细胞肺癌）分别约占30%～50%和19%，胆管癌约占26%，小肠癌、皮肤癌、膀胱癌和乳腺癌等癌症中也会发生突变[11]。KRAS基因中最常发生突变的位点是第12、13 和61 位的密码子，其中以12 位密码子的突变最为常见[12]。突变后的KRAS 会影响其与GAP 蛋白的结合能力，从而抑制GAP 诱导的GTP 水解。随着GTP 酶水解能力下降，GTP 逐渐积累，KRAS 更易与GTP 结合，进而使KRAS 大多处于激活状态[13]。最终导致其下游的多条信号通路被激活，诱发恶性肿瘤的发生与发展。

表 1 人类癌症中RAS 突变比例[10]Table 1 Proportion of RAS mutation in human cancers

2 KRAS G12C 抑制剂的设计策略以及临床研究进展

KRAS 与GTP（磷酸化的GDP）结合时，KRAS活性构象蛋白表面的Switch Ⅰ和Switch Ⅱ处于闭合状态。当KRAS 与GDP 结合时，不仅失去活性而且蛋白表面出现一些结合空腔[14]（见图3）。理论上，设计小分子靶向占据GTP 结合位点，就可以使KRAS 稳定在失活构象。但是由于KRAS 蛋白表面非常光滑，且仅有一个与GTP 结合的位点，再加之其与GTP 的亲和力非常强，细胞中GTP 浓度非常高，使得直接靶向GTP 结合位点的抑制剂极难发挥作用[15]。尽管研究人员尝试研发了多种竞争性GTP 小分子抑制剂，但均未取得成效。

近年来，对KRAS突变体的共价抑制剂的研究取得了较大进展。KRAS G12C是一种常见的KRAS突变[16]，当12 位甘氨酸突变为半胱氨酸后，有可能可以与小分子共价结合，因此研发与此半胱氨酸结合的变构位点（allosteric）抑制剂具有较好的开发前景[17]。加州大学的Ostrem 等[18]首次报道了具有一定活性的KRAS G12C 小分子抑制剂，验证了研发共价小分子抑制剂的可行性，从此开启了KRAS G12C 共价小分子抑制剂研发的新篇章（见表2）。

表 2 进入临床的KRAS G12C 小分子抑制剂Table 2 Small molecule inhibitors of KRAS G12C in clinical application

其中安进公司开发的AMG510 在不到1 年的时间里就获得了良好的临床结果，这也是首个公布临床试验数据的KRAS G12C 抑制剂，目前已经获得美国FDA批准用于治疗非小细胞肺癌以及结直肠癌[19]。Mirati 公司研发的KRAS G12C 抑制剂MRTX849 在临床试验中也表现出良好的抗肿瘤活性[20]。Wellspring 公司研发的ARS-853 表现出较好的细胞活性，但由于其药代动力学性质差，不适合进行体内研究[21]。随后他们研发了喹唑啉类新母核抑制剂ARS-1620，其对KRAS G12C 显示出较好的活性以及选择性，可快速使肿瘤消退，具有极大的开发潜力[22]。2019 年5 月，Wellspring 公司宣布美国FDA 批准了ARS-3248 的临床新药研究的申请，强生公司将对其进行Ⅰ期临床试验。而勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）的相关研究表明[2]，BI-2852能以纳摩尔级别与KRAS 蛋白结合，且对携带KRAS突变的肿瘤细胞均有抗增殖作用。除以上KRAS G12C小分子抑制剂外，还有多个制药企业（如辉瑞制药有限公司以及药明康德新药开发有限公司）未公开专利保护的化合物。KRAS 这一曾经被认为“不可成药”的靶点，迎来了新药开发的热潮。

3 KRAS G12C 小分子抑制剂

3.1 变构位点抑制剂

KRAS 变构位点抑制剂主要是通过改变KRAS 蛋白结构或干扰其与核苷酸交换因子（如SOS 蛋白）形成的蛋白-蛋白相互作用而发挥作用[22]。当前研究最多的是KRAS G12C 变构位点抑制剂，这些变构配体与KRAS G12C 的结合不会干扰鸟苷核苷酸底物位点，克服了KRAS G12C 与GTP 结合力极强的缺点[23]。本文将变构抑制剂按结构类型分为5 类：氨基乙酮类、喹唑啉类、四氢吡啶并嘧啶类、吡啶并嘧啶酮类以及吲哚类。

3.1.1 氨基乙酮类Ostrem 等[24]首次报道了KRAS G12C 特异性抑制剂，他们先通过二硫键碎片筛选得到了片段1，进一步结构优化得到了化合物2。化合物2和KRAS G12C 的共晶结构显示（图4 所示），化合物2 共价结合到Cys12 巯基上，并延伸到临近Switch Ⅱ（S-ⅡP）形成的空腔，但S-ⅡP 空腔并未被充分占据，更有效的共价结合基团可能有助于提高抑制剂活性。因此，研究人员设计丙烯酰胺和乙烯基磺胺等亲电基团代替二硫基团，获得了化合物3 和4。在10 μmol · L-1浓度下孵育24 h，它们对KRAS G12C 的抑制率可分别达87%和100%。二者不仅能够有效占据S-ⅡP，而且使KRAS 更倾向于与GDP 结合，从而使KRAS 更多地处于非活性状态。此外，化合物3 和4 对癌细胞也具有一定的抗增殖作用。该研究首次通过化合物与KRAS G12C 蛋白共晶体证明了占据S-ⅡP 结合位点在KRAS G12C 驱动的癌症中的应用，为KRAS G12C 特异性共价抑制剂的研究和开发提供理论指导。

由于化合物4 的细胞活性不佳，Patricelli 等[25]在此基础上开发了对非小细胞肺癌细胞株（H358）活性更优异的KRAS G12C 抑制剂。经延长化合物4 的烯丙基酰胺得到了化合物5（ARS-107），其对KRAS G12C 突变的肺癌细胞有微弱的活性（IC50= 63 μmol · L-1），显示出一定的抗肺癌细胞增殖潜力。此外，由于化合物5 的苯环上5 位氯对活性影响较大，对苯环进行结构优化获得了化合物6（ARS-853），其活性得到了显著提高（IC50= 1.6 μmol · L-1）。进一步分析化合物6 与KRAS 的共晶结构发现（如图5 所示），化合物6 的丙烯基酰胺能与12 位半胱氨酸形成共价键，且延伸到Switch Ⅱ区域；芳香环占据疏水性区域，环丙基与周围的氨基酸形成了较强的范德华力作用。细胞活性数据表明，化合物6 能够诱导细胞凋亡，延缓细胞生长，且对多种癌细胞具有抑制活性[26]。此外，化合物6 选择性地与非活性状态的GDP-KRAS 结合，使KRAS 锁定在失活状态。

3.1.2 喹唑啉类ARS-853（化合物6）虽表现出较好的细胞活性，但其药代动力学性质较差，不适于进行体内的药效评估。此外ARS-853 系列化合物结构修饰较为有限，限制了其进一步的药效改善。该系列母核的邻氨基酚和连接子区域是代谢位点，也是血浆稳定性和药代动力学较差的主要原因。因此，Janes 等[29]将重点转移到设计结构独特的母核上，头部丙烯酰胺直接连接氮甲基哌嗪，缩短连接子的距离，同时用喹唑啉取代邻氨基苯酚，使其恰好占据疏水区域，开发了喹唑啉母核类化合物[27]，克服了ARS-853 的缺点，具有更好的成药性特征。Wijeratne 等[28]首先从该专利中检索到化合物8，细胞测试结果表明，化合物8 对多种肿瘤细胞均展现出较好的抑制效果。

Janes 等[29]对化合物8 的对应异构体9（ARS-1620）进行了更加深入的研究。从化合物9 与KRAS 的共晶结构发现（如图6所示），化合物9的优势构象更加刚性，与H95 形成了额外的关键作用力。化合物9 与KRAS G12C 的结合速率（1 100±200 mol · L-1· s-1）比化合物8快了近1 000 倍（1.2±0.6 mol · L-1· s-1）。此外，化合物9 的细胞活性（IC50

= 0.150 μmol · L-1）也得到了很大的提高。进一步的体内研究揭示了其口服生物利用度高（F ＞ 60%）、药理特性以及血液稳定性均较好。同时，该化合物对KRAS G12C 具有高效性和选择性，可快速、持续地作用于体内靶点以诱导肿瘤消退。该研究提供了体内证据，揭示以ARS-1620 为代表的新一代KRAS G12C 抑制剂的巨大治疗潜力。

Zeng 等[30]基于S-ⅡP 结合位点对专利化合物10进行了进一步的结构优化，得到了另一种喹唑啉类化合物。通过在喹唑啉2 位引入氨基酰胺得到化合物11（1_AM）和12（2_AM）。与化合物10 相比，化合物11 可使GTP 与KRAS 的结合能力降低约80%，并能有效地抑制下游ERK 的磷酸化。除此之外，氨基酰胺的引入还增强了对KRAS G12C 的选择性。在化合物11 的基础上，将苯环换成萘环，同时保留氨基酰胺，得到了化合物13（3_AM）和14（4_AM），均具有较好的细胞活性（IC50分别为1.7 和0.73 μmol · L-1）。

3.1.3 四氢吡啶并嘧啶类Fell 等[31]基于结构筛选得到了四氢吡啶并嘧啶类化合物15，在5 μmol · L-1下化合物15 对KRAS G12C 的抑制率仅为13%。进一步优化得到了化合物16，其在5 μmol · L-1下的抑制率提高至99%，细胞活性为IC50= 7.6 μmol · L-1。鉴于嘧啶环2 位对活性影响较大，在2 位进行取代得到化合物17 和18，化合物17 与KRAS G12C 的共晶结构如图7 所示。与化合物16 相比合物17 和18 细胞活性得到了明显提升，IC50分别为540 和70 nmol · L-1。同时，二者能够抑制KRAS 下游效应因子（如ERK）的磷酸化。化合物18 的体内药效表明，腹腔给药5 d 可使肿瘤迅速消退，25 d 后肿瘤完全消除。此外，基于LC-MS（液相色谱-质谱）的检测显示，给药后，肿瘤组织中化合物18 与KRAS G12C 的结合率可持续大于65%。最重要的是，小鼠对化合物18具有较好的耐受性，未出现体质量减轻或其他不良症状等副作用。因此，以化合物18 为代表的四氢吡啶嘧啶类KRAS G12C 共价变构抑制剂具有良好的临床应用前景。

近期，Mirati 公司的四氢吡啶并嘧啶类KRAS G12C 抑制剂MRTX849（结构尚未报道）在临床试验中也表现出良好的疗效。MRTX849 最初是由Mirati 与Array 生物医药公司联合发现的，具有优异的细胞活性，IC50高达1 ～ 20 nmol · L-1。与报道的其他KRAS 抑制剂相比，MRTX849 具有抗肿瘤活性好、口服利用度高、半衰期长等良好的成药特性。

3.1.4 吡啶并嘧啶酮类2018 年Lanman 等[32]报道了吡啶并嘧啶酮类专利化合物（如化合物19），其对具有KRAS突变的前列腺癌细胞显示了优异的抑制活性（IC50= 0.211 μmol · L-1）。对其连接子区域以及疏水区结构优化得到了化合物20 和21，二者细胞活性均有了显著的提高（IC50值分别为0.054 和 0.012 μmol · L-1）。安进公司基于此专利化合物合成了化合物22（AMG510），晶体结构表明，化合物22 能很好地占据连接子区域，在疏水性区域能与周围氨基酸形成关键作用力，（见图8）。目前已经公布了AMG510 的临床Ⅰ期试验结果[33]，在入选的34 名患者中，大多表现出良好的缓解率，且较少出现副作用[34]。基于以上良好的临床结果，安进公司将会继续推进AMG510 单一疗法和组合疗法的发展计划。

3.1.5 吲哚类基于ARS-1620 较好的体内疗效，Shin 等[35]基于化学型进化技术筛选得到了化合物23，其对KRAS G12C的结合速率（表观速率常数kobs · [I]-1）为2 mol · L-1· s-1。从化合物23 与KRAS G12C 的共晶发现，Switch Ⅱ处于闭合的状态，H95、Y96 和Q99 形成了一个新的空腔，但23 并未占据此位点，（见图9a）。进一步结构优化得到了苯环母核24 和吲哚母核25 两类，其结合速率分别为26 mol · L-1· s-1和230 mol · L-1· s-1，吲哚母核类25 较化合物23 活性有了100 倍的提高。同时，二者对胰腺癌细胞表现了一定的活性（IC50分别为11.3 和11.4 μmol · L-1）。随后对吲哚母核类优化得到了26，其结合速率高达2 640 mol · L-1· s-1，细胞活性也有了极大的提高（IC50= 0.219 μmol · L-1）。共晶结果显示，四氢喹啉能很好的占据H95、Y96 和Q99形成的空腔，因此活性有了较大的提高，（见图9b）。

3.2 催化位点抑制剂

催化位点抑制剂直接作用于鸟苷核苷酸底物位点，这些抑制剂通过与核苷酸竞争活性位点，破坏GTP/GDP与KRAS 的结合，从而使其处于非活性状态[36]。长期以来，直接针对RAS 活性位点的小分子抑制剂的开发一直受到KRAS 与底物亲和力强，以及细胞中核苷酸浓度极高的阻碍。但是近期报道的成功的共价激酶抑制剂[37]，为解决KRAS竞争核苷酸位点的问题提供一种新的思路。

Lim 等[38]模拟GDP 设计了第一个底物-竞争共价抑制剂化合物27。在1 mmol · L-1GDP 或GTP 条件下孵育2 h，化合物27 与KRAS G12C 结合率＞ 95%。氢交换质谱显示，化合物27 改变了核苷酸结合口袋的构象，诱导其处于类似于与GDP 结合的非活性形式，从而影响RAS 和RAF 之间的蛋白-蛋白相互作用，化合物27与KRAS G12C 的共晶结构如图10 所示。

由于化合物27 是一种二磷酸盐化合物，其磷酸酐键易于水解，因此化学性质不稳定，膜穿透能力差。为了解决此问题合成了化合物28，化合物28 的细胞通透性增强，具有一定的抗癌细胞增殖活性，同时KRAS依赖的AKT 和ERK 通路也被抑制。Xiong 等[39]对化合物27 进行生物电子等排得到了化合物29，化合物29 的化学稳定性有了很大的提高。尽管与化合物27相比其对KRAS 的活性有所降低，但化合物29 仍然是一个非常有前景的前药化合物。

4 组合疗法

近期的临床结果显示，有些非小细胞肺癌患者已经出现了单药疗法的耐药性，而AMG510 对结直肠癌患者的部分缓解率只有不到10%[40]。因此各大公司逐渐转向组合疗法，主要有：与程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）免疫抑制剂联用、与相关信号通路靶点抑制剂联用以及与化疗药物联用。

4.1 与PD-1 抑制剂联用

研究表明，携带KRAS G12C的非小细胞肺癌患者的PD-1 表达水平较高，表明他们适合接受提高T 细胞抗肿瘤活性的抗PD-1 抑制剂的治疗[41]。Baraibar 等[42]研究了在KRAS 突变的肺癌患者中，阻断PD-1 通路，增强CD8/CD3 阳性T 细胞肿瘤浸润，显示了肿瘤治疗的优异效果。

Mirati 公司指出MRTX849 与PD-1 抑制剂联用可能具有协同效应[20]。安进公司的小鼠实验结果也表明[43]，单独使用AMG510 时，在10 只携带KRAS G12C 突变肿瘤的小鼠中，仅一只小鼠的肿瘤完全消退，单独使用PD-1 抑制剂的效果与此类似，但当联合用药时，10 只小鼠中有9 只携带的肿瘤长时间完全消退，且未出现复发。验证了KRAS G12C 抑制剂与PD-1 抑制剂联用时，能够增强抗癌效果。

4.2 与相关信号通路靶点抑制剂联用

同时抑制同一信号通路的不同靶点，或者不同的信号通路均可增强抗癌疗效。基于这一策略，Christensen等[44]研究了MRATX1257 与相关信号通路靶点抑制剂联用机制，为联合用药提供了思路。勃林格殷格翰公司近期将BI-2852 与分裂原活化抑制剂（MEK 抑制剂）联用，用于治疗胃肠道和肺癌。安进公司为了验证AMG510 是否也能与其他靶点产生协同效应，将AMG510 联合其他靶点抑制剂进行了相关实验[43]。结果表明，AMG510 与人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（HER 激酶抑制剂）、含Src 同源2 结构域蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂（SHP2 抑制剂）以及MEK 抑制剂均具有较强的协同作用。Misale 等[45]将KRAS 抑制剂与PI3K 抑制剂联用也产生了较好的协同效果。Lu 等[46]也研究了SHP2 抑制剂以及MEK 抑制剂对KRAS突变肿瘤的作用。这些数据表明，与同一信号通路的不同靶点的抑制剂联用，可以从源头制约这一信号通路，同时可能消除旁路或者残余信号传导，有助于提高抗肿瘤效果以及防止耐药性的产生。

4.3 与化疗药物联用

安进公司的研究人员首次尝试了将AMG510 与化疗药物卡铂联用[43]。对荷有肿瘤的模型动物的研究表明，单独使用AMG510 和卡铂时，均能显著缩小肿瘤的体积，但是当两者联用时，肿瘤体积能更快更明显地缩小，显著增强了抗肿瘤效果。这一结果为在临床试验中使用这一组合疗法提供了理论基础。

5 总结与展望

KRAS作为癌症中最常突变的致癌基因，由于其蛋白表面没有适合小分子抑制剂结合的口袋，导致直接靶向KRAS 的小分子药物开发在过去30 多年里没有重大突破。近年来的研究发现，在KRAS G12C 突变体中，存在着一个能够被共价抑制剂结合的变构位点。小分子抑制剂通过与突变生成的半胱氨酸共价结合，将KRAS G12C 的构象锁定在失活状态，从而抑制KRAS G12C突变体的活性。该发现使KRAS G12C 这一“不可成药”靶点有了重大突破，受到了业界的广泛关注。

目前已有多个KRAS G12C 抑制剂处于临床阶段。但临床结果同时也表明，有些患者已经出现单药疗法的耐药性。一些制药企业开始转向组合疗法的探索，将KRAS G12C 抑制剂与其他抑制剂联用显示出较强的抑制肿瘤效果以及不易产生耐药性的优势，这对KRAS G12C 抑制剂的临床试验推进具有重要意义。