苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达

关鹏　秦培钢　代小娟　宋金东

摘要：采用5对引物组合经2轮PCR扩增对苏云金芽孢杆菌QL75-2菌株中的cry基因进行鉴定，克隆得到1个cry1Da型基因片段。通过设计全长引物扩增得到该cry基因的全长序列，转入原核表达载体pET-28a中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，最后对表达蛋白进行生物活性分析。序列分析结果表明，该cry1Da基因全长3 495 bp，推测其编码1 164个氨基酸，组成分子量约132.01 ku的蛋白质。该预测蛋白质与已知的Cry1Da3蛋白质具有最高的序列同源性（99.7%），该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Da5。生物活性分析结果表明，Cry1Da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性，其LC50为21.47 μg/mL，而对鳞翅目的棉铃虫幼虫无杀虫活性。因此，cry1Da5基因可作为一个新的cry基因资源在甜菜夜蛾的生物防治中应用。

关键词：苏云金芽孢杆菌;简并引物;cry1Da5基因;棉铃虫;甜菜夜蛾;杀虫活性

中图分类号： S182

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）02-0118-05

收稿日期：2018-10-26

作者简介：关 鹏（1984—），男，陕西渭南人，博士，讲师，主要从事微生物杀虫剂研究。E-mail：guanpeng0719@163.com。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在芽孢形成过程中能够产生形态多样的伴胞晶体（又称杀虫晶体蛋白或 δ- 内毒素，由cry、cyt基因编码），这些伴胞晶体对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、螨类、线虫等农林及卫生害虫具有特异性的杀虫活性[1-2]，因此Bt菌株及其杀虫基因被广泛应用于农林、卫生害虫的生物防治。

在已知的75类cry基因中，cry1类基因编码蛋白主要对鳞翅目害虫具有广泛的杀虫活性，然而不同的Cry1类蛋白存在不同的杀虫谱。例如Cry1Ac和Cry1Ca对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼虫均有显著的杀虫活性[3-5];棉铃象甲（Anthonomus grandis）和草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼虫对Cry1Ia敏感[6];Cry1Ab和Cry1Fa主要对玉米螟（Corn bore）、草地夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性[7];Cry1Da对甜菜夜蛾、小菜蛾（Plutella xylostella）等夜蛾科害虫具有明显的杀虫活性[8-10]。

cry基因的鉴定多采用宋福平等建立的限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）基因鉴定体系[11]，通过对同一大类的不同cry基因进行序列比对，根据保守区域设计该类型cry基因的通用引物，然后利用PCR的方法对Bt菌株中的cry基因片段进行扩增，并采用不同的DNA内切酶对扩增产物进行双酶切鉴定。本研究采用的是Berón等创建的一种新的cry基因鉴定方法[12]，首先对不同大类cry基因编码蛋白质序列进行比对，得到蛋白质的保守区域，然后根据其对应的核酸序列，分别设计5条简并引物，然后通过2轮PCR扩增，并结合测序方法对Bt QL75-2菌株中的cry基因进行鉴定、全长扩增及原核表达，并对表达产物进行杀虫活性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 野生型苏云金芽孢杆菌QL75-2菌株、大肠杆菌DH5α感受态细胞由笔者所在实验室保存。

1.1.2 供试昆虫 棉铃虫、甜菜夜蛾幼虫为笔者所在实验室饲养的标准化测试昆虫。

1.1.3 培养基 LB（Luria-Bertani）液体培养基：称取10 g蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物，加无菌水定容至 1 000 mL;LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉;1/2 LB液体培养基：将LB液体培养基中的各成分均减半后，加无菌水定容至1 000 mL;1/2 LB固體培养基：在1/2 LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉。将配制好的培养基置于121 ℃条件下高温蒸汽灭菌20 min。

1.1.4 试剂 pMD19-T载体、T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司;DNA Marker、蛋白质Marker、氨苄青霉素、X-gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;Axygen DNA凝胶回收试剂盒、Axygen质粒小量提取试剂盒购自上海百赛生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Bt质粒DNA的提取及cry基因的鉴定 采用 Reyes-Ramírez等的方法[13]提取Bt质粒DNA。cry基因的鉴定参考Berón等的方法[12]，首先以Bt QL75-2菌株质粒DNA为模板，使用OL1和OL5引物组合进行第1轮扩增，然后将扩增产物稀释50倍后作为扩增模板，采用OL1-OL5、OL1-OL4、OL2-OL5、OL2-OL4、OL3-OL5等5对引物组合分别进行第2轮PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性45 s，40 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，循环35次;72 ℃ 延伸3 min。对扩增产物进行电泳检测并回收，将回收产物送深圳华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.2 cry基因的全长克隆及测序 利用NCBI BLASTx在线分析工具对“1.2.1”节中扩增得到的基因片段进行序列比对，根据比对结果，设计并合成cry基因全长扩增引物（正向引物cry1Da-F：5′-ATGGAGATAAATAATCAG-3′，反向引物cry1Da-R：5′-CTATTCCTCCATAAGGAG-3′）。将扩增产物与克隆载体pMD19-T连接，然后转入大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选获得阳性单克隆，最后对阳性单克隆中的插入基因序列进行测序分析。

1.2.3 cry1Da基因的序列分析 利用NCBI数据库中的BLASTx工具对cry1Da基因序列进行同源性分析;采用Vector NTI Advance 11和DNAStar软件对cry1Da基因及相似序列进行多序列比对;采用DNAMAN 6.0.40软件选择基因酶切位点，并对通过cry1Da基因预测的编码蛋白质序列进行同源性分析。

1.2.4 cry1Da5基因的原核表达及检测 根据大肠杆菌表达载体pET-28a的多克隆位点，使用DNAMAN 6.0.40软件对cry1Da5基因序列进行酶切位点分析，设计并合成cry1Da5基因表达扩增引物，正向引物cry1Da5-F：5′-GCGTCGACATGGAGATAAATAATCAG-3′（下划线部分为SalⅠ酶切位点），反向引物cry1Da5-R：5′-CCGCTCGAGCTATTCCTCCATAAGGAG-3′（下划线部分为XhoⅠ酶切位点），使用高保真Pfu DNA聚合酶对Bt QL75-2菌株中的cry1Da5基因进行PCR扩增。扩增产物与pET-28a载体分别经过SalⅠ和XhoⅠ的双酶切后，通过T4连接酶连接，获得重组子pET-cry1Da5，将重组子转入到大肠杆菌DH5α中;对阳性单克隆中的重组质粒进行酶切分析验证;最后将重组质粒转入到大肠杆菌BL21（DE3）中，加入 200 μL 1 μmol/mL IPTG溶液，在28 ℃，200 r/min 条件下诱导表达10 h。取少量培养产物用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白电泳检测[14]。Cry1Da5表达蛋白的提取参考Schgger等的方法[15]。

1.2.5 Cry1Da5蛋白杀虫活性的测定 将称质量后的Cry1Da5表达蛋白加入到10 mL无菌水中，振荡混匀制成悬液，采用梯度稀释法将悬液浓度分别稀释为5、10、20、40、80、160 μg/mL等，分别与适量养虫饲料均匀混合，分装于12孔培养板中。每孔放2头二龄期棉铃虫或甜菜夜蛾幼虫，每个浓度重复3次，将加无菌水的饲料作为空白对照，培养3～5 d后统计结果。采用SPSS 10.0软件对统计结果进行分析并计算致死中浓度（LC50）。

2 结果与分析

2.1 Bt QL75-2菌株中cry基因的鉴定

DNA电泳结果（图1）表明，5对引物组合均可扩增得到产物，其中OL1-OL5、OL2-OL5、OL3-OL5引物组合均扩增得到1个大小约500 bp的DNA片段;OL2-OL4引物组合扩增得到1个大小约750 bp的产物;OL1-OL4引物组合扩增得到1个大小约1.1 kb的DNA片段。对这些PCR产物进行测序分析，结果表明，OL1-OL4引物组合的扩增产物序列长1 126 bp，是与已知的cry1Da3基因序列同源性为99.8%的cry1Da型基因片段;而另外4对引物组合的扩增产物均非cry基因片段。

2.2 cry基因的全长克隆及其序列分析

利用引物cry1Da-F和cry1Da-R对“21”节中的cry1Da型基因的全长序列进行扩增，并对扩增产物进行电泳检测，结果（图2）表明，扩增得到1个长约3.5 kb的DNA序列。对该序列进行测序分析，生物信息学分析结果（图3）表明，该基因序列全长3 495 bp，推测其编码1 164个氨基酸（图4），组成分子量约为132.01 ku的蛋白质，等电点为5.29。Cry1Da类蛋白质序列比对分析结果（表2）表明，本研究预测的Cry1Da蛋白质与其他已知的Cry1Da类蛋白质的氨基酸序列均存在差异，该蛋白质与已知的Cry1Da3蛋白质具有最高的序列同源性（997%），二者之间仅有4个氨基酸不同。根据国际Bt杀虫晶体蛋白质基因的命名规则，该基因被正式命名为cry1Da5（GenBank登录号为MG181949）。

2.3 cry1Da5基因的原核表达

表達产物的SDS-PAGE分析结果（图5）表明，cry1Da5基因表达大小约130 ku的产物，这与预测的cry1Da5基因编码的蛋白质分子量大小一致。

2.4 Bt QL75-2菌株的生物活性分析

生物活性测定分析结果（表3）表明，Cry1Da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较明显的杀虫活性，其LC50为21.47 μg/mL，95%的置信区间为18.33～24.61 μg/mL;但是该蛋白质对棉铃虫幼虫不具有杀虫活性。

3 讨论

本研究采用Berón等的方法[12]从Bt QL75-2菌株中鉴定得到1个cry1Da5基因，进一步验证了该方法的可行性。该鉴定方法与宋福平等的方法[11]相比，其优点为：（1）合成引物少，节约引物合成的成本;（2）对于较多Bt菌株的鉴定，所进行的PCR扩增次数较少，且省去了双酶切检验的过程;（3）采用简并引物对cry基因进行鉴定，易得到新型基因。然而该方法也存在一些缺点，在PCR扩增中引物的错配率较高，非目标产物较多，且PCR产物主要通过测序来验证其正确性，导致测序成本较高。

生物活性分析结果表明，Cry1Da5蛋白质对甜菜夜蛾具有较强的杀虫活性，另外，序列比对结果发现，Cry1Da5与Cry1Da3蛋白质的同源性最高，仅有4个氨基酸存在差异，而黄天培等研究发现，Cry1Da3蛋白质对甜菜夜蛾和小菜蛾均具有高效的杀虫活性[16]，因此，上述研究结果均证实了Cry1Da类蛋白质主要对夜蛾科昆虫具有特异性的杀虫活性。

尽管cry基因被广泛地应用于农林及卫生害虫的生物防治，但是昆虫的抗性问题一直是cry基因应用的一个瓶颈。近年来，新cry基因资源的不断挖掘、不同cry基因的重组或协同表达成为解决昆虫抗性问题的有效方法。因此，新发现的cry1Da5基因将作为新的备选基因在害虫生物防治中被应用。

表2 Cry1Da与其他Cry1Da类蛋白质氨基酸序列间的差异性比较

名称差异氨基酸数目（个）Cry1Da1Cry1Da2Cry1Da3Cry1Da4Cry1Da383846

参考文献：

[1]Priesnitz K U，Vaasen A，Gathmann A. Baseline susceptibility of different European lepidopteran and coleopteran pests to Bt proteins expressed in Bt maize：a systematic review[J]. Environmental Evidence，2016，5（1）：16-27.

[2]Soares-da-Silva J，Queirós S G，de Aguiar J S，et al. Molecular characterization of the gene profile of Bacillus thuringiensis Berliner isolated from Brazilian ecosystems and showing pathogenic activity against mosquito larvae of medical importance[J]. Acta Trop，2017，176：197-205.

[3]Kim H S，Noh S，Park Y. Enhancement of Bacillus thuringiensis Cry1Ac and Cry1Ca toxicity against Spodoptera exigua （Hübner） by suppression of a chitin synthase B gene in midgut[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology，2017，20（1）：199-205.

[4]Reinoso-Pozo Y，Rincón-Castro M C D，Ibarra J E. Significant increase in toxicity of the Cry1Ac1 protein of Bacillus thuringiensis by the exchange of two amino acids in its domain III[J]. Biological Control，2018，125：1-6.

[5]王 杨，周子珊，刘永磊，等. 对甜菜夜蛾具有杀虫活性的Bt菌株cry1Ca基因研究[J]. 植物保护，2016，42（2）：19-25，37.

[6]Grossi-de-Sa M F，Quezado de Magalhaes M，Silva M S，et al. Susceptibility of Anthonomus grandis （cotton boll weevil） and Spodoptera frugiperda （fall armyworm） to a cry1Ia-type toxin from a Brazilian Bacillus thuringiensis strain[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2007，40（5）：773-782.

[7]Hernández-Rodríguez C S，Hernández-Martínez P，Rie J V，et al. Shared Midgut binding sites for Cry1A.105，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac and Cry1Fa proteins from Bacillus thuringiensis in two important corn pests，Ostrinia nubilalis and Spodoptera frugiperda[J]. PloS One，2013，8（7）：e68164.

[8]Hernández-Martínez P，Ferré J，Escriche B. Susceptibility of Spodoptera exigua to 9 toxins from Bacillus thuringiensis[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2008，97（3）：245-250.

[9]BenFarhat-Touzri D，Saadaoui M，Abdelkefi-Mesrati L，et al. Histopathological effects and determination of the putative receptor of Bacillus thuringiensis Cry1Da toxin in Spodoptera littoralis midgut[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2013，112（2）：142-145.

[10]BenFarhat-Touzri D，Driss F，Jemli S，et al. Molecular characterization of Cry1D-133 toxin from Bacillus thuringiensis strain HD133 and its toxicity against Spodoptera littoralis[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2018，112：1-6.

[11]宋福平，张 杰，黄大昉，等. 苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立[J]. 中国农业科学，1998，31（3）：13-18.

[12]Berón C M，Curatti L，Salerno G L. New strategy for identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains[J]. Applied And Environmental Microbiology，2005，71（2）：761-765.

[13]Reyes-Ramírez A，Ibarra J E. Plasmid patterns of Bacillus thuringiensis type strains[J]. Applied And Environmental Microbiology，2008，74（1）：125-129.

[14]Pilhofer M，Bauer A P，Schrallhammer M，et al. Characterization of bacterial operons consisting of two tubulins and a kinesin-like gene by the novel Two-Step Gene Walking method[J]. Nucleic Acids Research，2007，35（20）：e135.

[15]Schgger H，von Jaqow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD[J]. Analytical Biochemistry，1987，166（2）：368-379.

[16]黃天培，束长龙，张 杰，等. 苏云金芽孢杆菌基因cry1Da3及其应用：CN201310286693.0[P]. 2013-07-09.李周康，吕光辉，龚雪伟，等. 不同生活型植物吸收凝结水后水分及荧光生理差异[J]. 江苏农业科学，2020，48（2）：123-130.