甘蓝型油菜启动子pBnaC05g31880D的克隆与功能分析

华兆晖　范世航　李俊

摘要：以甘蓝型油菜冬性品种中双11的基因组为模板，克隆了BnaC05g31880D基因起始密码子上游-1 525 bp的启动子序列。顺式调控元件的预测分析表明，该启动子含有真核生物启动子必需的核心调控元件TATA box和CAAT box，同时还存在较多的其他功能元件，如光信号响应调控元件ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element、TCT-motif，厌氧感应必需的顺式作用元件ARE，茉莉酸甲酯响应顺式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif，玉米醇溶蛋白代谢调控元件O2-site，赤霉素响应元件P-box等。为了验证该启动子的表达模式，构建了由其驱动GUS报告基因的植物融合表达载体DX2181G-pBnaC05g31880D，并采用农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥（Col-0）。对筛选和鉴定的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色，结果表明，GUS活性在拟南芥的各个组织中均有较强表达水平，这表明pBnaC05g31880D具有驱动GUS报告基因在拟南芥各个组织中组成型表达的特性。这为该启动子在油菜转基因提高作物品质和人工创建种质资源等方面的应用提供了较好的基础。

关键词：甘蓝型油菜;启动子;GUS染色;组成型;克隆;功能

中图分类号： Q943.2;S634.301

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）02-0065-08

收稿日期：2019-01-09

作者简介：华兆晖（1999—），男，湖北武汉人，研究方向为生物技术。E-mail：hzh302758578@163.com。

通信作者：李 俊，博士，助理研究员，研究方向为功能基因组学。E-mail：lijun@oilcrops.cn。

启动子在基因的转录和表达调控中起关键性作用，是核酸序列分子上被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。组成型表达启动子、组织/器官特异性表达启动子和诱导型表达启动子为启动子转录的3种模式[1]。目前在植物基因工程领域，研究和使用最为深入广泛的是组成型启动子，组成型启动子的优势是能够驱动目的基因在受体植株中的不同生长时期和不同组织器官中稳定表达。其中，在双子叶植物中，花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、细菌胭脂氨酸合成酶nos启动子、水稻肌动蛋白Act启动子、是科研工作普遍使用的启动子工具[2-4]。在转基因研究工作中，异源表达目的基因使用同源或近源的启动子更有利于受体细胞调控因子的识别，减少甲基化，促进外源基因的整合，提高转化表达效率[5-7]，而来源于病毒的CaMV35S启动子可能具有生物安全的不确定性。李杰等在转基因盐藻的研究中发现，内源型启动子比外源启动子更有优势[8]。

油菜是十字花科芸薹属的重要一员，是四大油料作物之一，位居全球五大经济作物，是食用植物油的重要来源。自1985年首例转基因油菜问世以来[9]，油菜基因工程已经发展较为迅猛，利用分子育种手段改良油菜品种品质，较传统育种更加明确、快速。但至今没有得到稳定高效表达目的基因的油菜内源组成型启动子，使油菜基因工程相对受限，而采用外源病毒启动子35S等，更加加重了普通消费者对转基因安全的疑虑。因此，在双子叶植物油菜中研究内源组成型启动子，对于双子叶植物的遗传改良分子育种等具有重要的应用价值。本研究通过试验分析，发现启动子pBnaC05g31880D呈现出很强的组成型表达特性，在pBnaC05g31880D转基因拟南芥中，其所驱动的报告基因GUS（β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶）[10]在转基因拟南芥的根、茎、叶、花、角果、胚珠中都表现出很强的表达水平，这些数据充分表明pBnaC05g31880D是一个很强的组成型表达启动子，在植物转基因育种中具有良好的应用前景，也为油菜近源物种的转基因研究提供了良好的启动子材料。

1 材料与方法

1.1 材料和試剂

目的序列的模版来源为甘蓝型油菜品种中双11 DNA，为笔者所在实验室提取保存。植物双元表达载体DX2181G、大肠杆菌感受态DH5α、野生型拟南芥Arabidopsis thaliana（Columbia）、农杆菌感受态菌株GV3101均为笔者所在实验室制备保存。紫外分光光度计（NP80）、荧光实时定量PCR仪（ABI sds7500fast）为笔者所在实验室仪器。一步快速重组试剂盒ClonExpress Entry One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，引物合成及单菌落测序为生工生物工程（上海）股份有限公司完成，RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen，DNA Marker等购自大连宝生物公司，快速内切酶购自Thermo Fisher Scientific。温室培养条件为22 ℃/24 ℃、8 h/16 h。

1.2 目的片段的序列分析

笔者所在实验室前期的全基因组测序结果显示，BnaC05g31880D基因（Sequence ID：GCF_000686985.2）的转录区上游有1 525 bp的基因间隔序列，初步预测该区域为基因BnaC05g31880D的启动子序列[11]，命名为pBnaC05g31880D。启动子的功能行使依靠的是各种元件，元件的类型、多少决定了其启动下游目的基因的表达强度、效率和时空性[12]。在线分析软件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）是预测启动子序列功能元件的有效工具，可以对后续研究起重要指导意义[13]。

1.3 目的片段的克隆

以全基因组测序结果为参考，在启动子pBnaC05g31880D序列的N端和C端，利用在线引物设计软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）[14]进行序列特异引物设计（表1）。之后分别在上下游引物的5′端加上对应酶切载体的酶切位点及酶切位点的侧翼序列15 bp，作为融合重组引物，用于后续的一步重组的载体构建工作。

启动子序列目的片段的克隆按50 μL PCR体系配制：2×Mix 25 μL，P_BnaC05g31880D （Hind Ⅲ）-F 1.5 μL，P_BnaC05g31880D （BamH Ⅰ）-R 1.5 μL，Darmor DNA 2 μL，ddH2O 20 μL。PCR的运行程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36个循环;72 ℃ 8 min;4 ℃保存。PCR结束后，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测条带是否单一，大小是否正确，并切胶回收目的条带，回收产物用紫外分光光度计检测其质量。

1.4 植物表达载体构建

植物双元表达载体DX2181G的原核抗性为卡那霉素，真核抗性为潮霉素，多克隆酶切位点的下游含有GUS标记基因，是研究启动子功能的良好骨架载体[15]。提取的高质量质粒按照酶切体系（vector：40 μL;10×buffer：5 μL;Hind Ⅲ：2.5 μL;BamH Ⅰ：2.5 μL），37 ℃反应30 min，按照试剂盒说明书纯化回收酶切好的质粒并检测回收质量。按照一步快速重组试剂盒（ClonExpress Entry One Step Cloning Kit）说明书进行载体构建（5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，酶切后的载体质粒1 μL-100 ng，PCR产物1 μL-50 ng，Exnase Ⅱ 2 μL，ddH2O 4 μL），37 ℃ 恒温反应30 min后至于冰水混合物上静置 5 min，之后用移液器加入到预先拿出在冰上融化的大肠杆菌感受态DH5α。37 ℃恒温摇床复苏45 min后，转入LB固体培养基（含50 mg/L卡那霉素）倒置过夜培养筛選。用测序引物（DX2181-F+DX2181-R）PCR鉴定单菌落并对正确的进行测序，提取质粒转化农杆菌感受态GV3101，阳性单菌落用50%甘油1 ∶1保存于-80 ℃冰箱。

1.5 拟南芥的遗传转化及分子鉴定

具有形态小、生长周期短、闭花授粉等特性的拟南芥，作为模式作物来进行基因工程研究，具备诸多优势。采用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，在初花期，浸染花絮1 min，1周后进行二次重复浸染。收获的种子（T1）用含25 mg/L潮霉素的1/2 MS固体培养基筛选，点播于培养基后，在黑暗条件下培养3 d，再在光照下培养5 d，下胚轴长、叶色发绿的移栽于培养土中继续生长。抽薹前对每一单株编号并提取其叶片DNA，经PCR鉴定[DX2181-F/P_ BnaC05g31880D（BamH I）-R]后根据条带大小确定阳性单株并收获成熟后的种子（T2）。依次继代播种，筛选得到不发生抗潮霉素分离的纯合转基因株系，利用纯合株系作为后续研究的对象。

1.6 转基因株系的GUS组织化学染色分析

剪取纯合株系拟南芥不同时期不同组织样品进行GUS染色，具体染色组织和器官如下：成熟种子，成熟种子的胚胎，成熟种子的种皮，15 d幼苗，25 d幼苗、根、茎、叶、花、角果、幼嫩胚珠、幼嫩胚胎、幼嫩种皮。取样后置于2.0 mL离心管或大小合适的容器中，加入适量GUS染色液（50 mmol/L铁氰化钾;50 mmol/L亚铁氰化钾;50 mmol/L PBS，pH值为7.0;10 mmol/L EDTA、0.001% Triton X-100以及20%甲醇;0.5 mol/L X-Gluc），以全部没过染色组织为基本量。于37 ℃恒温孵育反应12 h或过夜，之后用75%乙醇脱色12 h，期间更换脱色液2次。脱色完成后，利用体视镜（Olympus SZX7）进行观察拍照。组织或器官着色为蓝色的即GUS基因表达的部位，也就是启动子发挥功能启动下游基因的部位，染色越深表示启动子在该部位越强，启动了下游GUS基因，通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索pBnaC05g31880D启动下游基因的时空表达模式。

1.7 油菜内源基因BnaC05g31880D表达量及转基因拟南芥GUS表达量检测来源于油菜的内源基因BnaC05g31880D在油菜自身的表达量一定程度上代表了其上游启动子的作用模式。启动子pBnaC05g31880D来源于油菜基因组，其下游的内源基因为BnaC05g31880D，研究BnaC05g31880D在油菜不同组织中的表达量可以为研究启动子pBnaC05g31880D的时空特性提供参考。设计BnaC05g31880D的半定量PCR引物（q_BnaC05g31880D-F、q_BnaC05g31880D-R），内参基因为At_β-actin（q_Bn_β_actin-F、q_Bn_β_actin-R），PCR程序设置为20个循环，在油菜的不同组织，即萌发7 d幼苗、根-三叶期、叶片-三叶期、茎-花期、腋芽-花期、叶片-花期、花蕾-花期、角果-10DAF（花后10 d）、角果皮-25DAF（花后25 d）、胚胎-25DAF、胚乳-25DAF、胚胎-35DAF（花后35 d），检测其相对表达量。

取样纯合株系转基因拟南芥的不同组织部位（根、茎、叶、花、角果、胚珠），提取RNA，反转录为cDNA后作为模版，以野生型拟南芥WT为对照，内参基因为Bn_β-actin（q_Bn_β_actin-F、q_Bn_β_actin-R），进行实时定量PCR检测，运行结束后获得的原始数据采用2-ΔΔCt法进行统计学分析，反映目的基因GUS的相对表达水平[16]。

2 结果与分析

2.1 BnaC05g31880D基因的启动子序列分析

PlantCARE对在线pBnaC05g31880D序列的启动子功能元件分析结果（图1，表2）显示，该序列所包含的功能元件数量庞大，种类较多，有启动子核心元件TATA-box 37个，启动子和增强子共同的核心元件CAAT-box 28个，光信号响应相关元件ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element和TCT-motif共计10个，厌氧调控元件ARE 2个，茉莉酸响应调控元件motif 2个，玉米醇溶蛋白代谢调控元件O2-site 1个，赤霉素响应元件P-box 1个，以及其他功能未知的功能元件25个。

2.2 目的片段的克隆

pBnaC05g31880D序列的大小为1 525 bp，PCR产物的电泳检测结果见图2，对比核酸marker发现，扩增产物条带单一，且大小相符，为目的产物。切胶回收后检测浓度为56 ng/μL。

2.3 载体DX2181G-pBnaC05g31880D的构建

经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3）显示酶切完全，把目的条带切胶纯化回收并检测回收质量为110 ng/μL。回收的线性化载体和PCR产物按照一步重组法融合构建重组载体（图4），转化后经单菌落鉴定为阳性的送测序公司测序，排除突变和方向错误，获得与参考序列完全一致的单菌落，提质粒并保存菌液，命名为DX2181G-pBnaC05g31880D。

2.4 pBnaC05g31880D启动子的功能分析

从61个T1代拟南芥单株样品中鉴定得到49个阳性的株系（部分PCR鉴定结果见图5），阳性率为80.33%。经3代筛选得到纯合转基因株系，经不同组织器官的GUS染色（图6），在转基因拟南芥的成熟种子萌发1、3 d幼苗以及35 d幼苗、茎、花、角果、幼嫩胚珠、幼嫩胚胎等不同组织和器官中都有很强的着色结果，这表明GUS基因在启动子pBnaC05g31880D的作用下，在不同组织器官中都发生了转录表达，且表达强度很高。

2.5 油菜内源基因BnaC05g31880D表达量分析及转基因拟南芥GUS表达量分析BnaC05g31880D在油菜萌发7 d幼苗、根-三叶期、叶片-三叶期、茎-花期、腋芽-花期、叶片- 花期、花蕾-花期、角果-10DAF、角果皮-25DAF、胚胎-25DAF、胚乳-25DAF、胚胎-35DAF中的半定量结果（图7）显示，该基因在油菜各个组织中的表达稳定高效，表明该基因的上游启动子对于目的基因起泛表达的作用。在转基因pBnaC05g31880D的拟南芥中，实时定量PCR结果（图8）显示，GUS基因在根、茎、叶、花、角果、胚珠各个组织中的表达量都较高，表现为组织间的泛表达特性，即组成型表达。

3 讨论与结论

启动子序列的功能元件预测结果表明，pBnaC05g31880D的1 525 bp的序列中包含了37个启动子核心元件TATA-box，28个启动子和增强子共同的核心元件CAAT-box，共计10个光信号响应相关元件 ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element 和TCT-motif，2个厌氧调控元件ARE，2个茉莉酸响应调控元件motif，1个玉米醇溶蛋白代谢调控元件O2-site，1个赤霉素响应元件 P-box，以及25個其他功能未知的功能元件，共计106个，平均14个碱基就有1个功能元件，数量多，且较为密集。特别是其中72个（68%）功能元件位于-1～-760 bp的区域内，这预示着该启动子的功能区在-1～-800 bp 内，这样其序列就缩短了近一半，更加适合应用推广。

油菜在我国的食用植物油中占有很重要的地位，依靠传统的育种模式提高油菜品质已经在过去的几十年内到达了一个瓶颈期。而依托于基因工程的分子育种，针对性更强，周期更短，通过基因工程来定向改良作物，是当今品质改良的重要课题。那么筛选得到油菜内源的组成型表达的启动子就很迫切，也很必要，利用油菜内源的组成型表达启动子表达目的基因，定向改良作物品质，也为双子叶植物的其他近源物种提供了参考。

本研究成功筛选得到1个来源于油菜的启动子，其驱动下游GUS基因转化拟南芥的GUS染色结果显示，GUS在转基因拟南芥的不同时空不同组织中均有较强的表达效果。这一启动下游基因组成型表达的启动子，对分子育种改良作物品质具有潜在的应用价值。

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