猪伪狂犬病病毒变异株在国内的研究进展

徐宁，栾美慧，郜艳雪，葛桂阳，李东丽，刘艺，宫庆龙，冷雪*，杜锐

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室/吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林 长春 130118)

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，该病作为自然疫源性疾病，可感染包括猪牛羊在内的40多种家畜、家禽、野生动物等，但是猪是唯一能够在急性原发感染中存活并且表现出亚临床症状和潜伏感染特性的宿主，不同年龄段的猪均可感染PRV并表现出不同的临床症状：幼猪主要表现为神经症状，即呕吐、搔痒、颤抖、瘫痪、腹泻等，并可能死于严重的脑脊髓炎；怀孕的母猪感染PRV会导致胎儿流产或死亡[1]；成年猪则会出现发热和呼吸道症状，且呈潜伏感染状态，即耐过后长期带毒排毒[2]继而成为隐蔽传染源，这一感染特性严重阻碍了伪狂犬病的防治及根除。

传统的Bartha-k61株疫苗因具备良好的免疫效果而被广泛使用，但是近年来PRV变异较为明显，导致传统疫苗的保护效果大幅度降低，自2011年开始，猪伪狂犬病再次在Bartha-k61株疫苗免疫过的猪场发生[3]，相比于传统PRV毒株，PRV流行变异株致病力明显增强，感染猪表现出更明显的临床症状和病理变化，发病率和死亡率也明显增高，给我国的养猪业造成巨大的经济损失。

1 PRV的特征

PRV属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是一种具有泛嗜性、嗜神经性和潜伏感染等特性的病毒。

1.1 理化特征

PRV粒子在形状上呈球形，未成熟的病毒粒子直径约在120～150 nm之间，带包膜的成熟的病毒粒子直径约在150～180 nm之间。在结构上从内到外共分为4层，分别为双链DNA病毒核心、二十面体核衣壳、包含蛋白质的皮层以及被囊膜蛋白包围的外膜层[4]。因此PRV对有机溶剂乙醚、氯仿等极度敏感[5]，经5%苯酚处理2 min或接触0.5%～1%氢氧化钠就可使其迅速灭活；但PRV对热耐受，完全灭活PRV需55～60 ℃持续30～50 min，80 ℃持续3 min，100 ℃持续1 min。

1.2 基因组特征

PRV是双链线性DNA病毒，基因组全长约为143 kb，全基因组由4部分构成，分别为独特长区段(UL)、短区段(US)、内部重复区段(IR)和末端重复序列(TR)[6-7]。目前对于UL区段的研究较为深入，PRV病毒的基因组通过滚环复制进行扩增，位于UL区段的某些基因以一定的方式调控病毒的复制，其中UL5、UL8、UL9、UL42与UL52等基因的转录翻译产物均参与其复制过程[8]，除此之外，UL区段还分布着多个毒力基因，如gB(UL27)、gC(UL44)、gM(UL10)及TK(UL23)基因，这些基因与US区段的gD(UL6)、gI(US7)、gE(US8)基因共同决定病毒毒力。

2 PRV变异株流行情况

由于猪伪狂犬病具有潜伏感染，高致病性，高死亡率等特性，在很大程度上限制了我国猪场集约化养殖模式的发展，该病一直是研究热点之一。多年来我国通过免疫接种，野毒监测及净化等技术手段，已经使疫情得到有效控制。但是自2011年起，猪伪狂犬病再次在我国河北和山东等养殖密度较大的华北地区暴发流行，随后疫情蔓延至我国中东部十余个省(市)，至2014年已蔓延至全国[9]，许多规模化的猪场都不同程度上出现了传统疫苗免疫失败的情况，具体表现为接种过传统疫苗的猪群再次表现出疑似猪伪狂犬病的临床症状，感染猪的发病率和死亡率呈明显上升趋势。经相关毒力基因测序表明新的PRV变异株抗原性已发生一定变异，分属于一个相对独立的分支，传统的PRV毒株属于基因Ⅰ型，而变异株属于基因Ⅱ型。相比于经典强毒株，PRV变异株引起的临床症状更明显，传播速度更快，致死率更高，呈现出毒力增强的趋势[10]。

3 PRV变异株主要毒力基因及其遗传变异

3.1 TK基因

TK基因位于UL区，长约963 bp，共编码320个氨基酸。TK基因虽然是PRV体外复制的非必需基因[11]，但却是PRV最主要的毒力决定因子，其编码蛋白对PRV的毒力影响最大。因此TK基因常作为缺失致弱疫苗的主要靶基因[12]。同时，TK基因还以一定的方式调控PRV的潜伏感染及其在中枢神经系统中的增殖过程，在很大程度上决定病毒的长期感染性和嗜神经性。

由于存在保守序列，TK基因具有严格的保守性。黄艺珠等[13]从山东省某发病猪场分离鉴定得到PRV变异株并命名为SD株，将其 TK基因与国内外8个PRV毒株TK基因序列相比较，结果显示SD株与匈牙利的 Bartha 株、Kaplan 株及韩国的 Yangsan 株相比核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.4%～99.7%和99.7%，与国内其他毒株相比核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%～99.5%和97.6%～98.8%，与国外毒株同源性较高，说明SD 株可能是由国外毒株变异而来；王琳等[14]对河南省PRV变异株冀A株TK基因序列分析结果表明，冀 A 株 TK 基因与 GenBank 中收录的国内外其他PRV毒株TK基因同源性都在99%以上，且都具有共同的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P *AR-，该结论与王勤等[15]报道的PRV TK、gD基因具有高度保守性的结果相吻合，与参考毒株相比，冀A株TK基因编码的氨基酸存在丙氨酸(Ala)284→缬氨酸(Val)284变异，该突变为冀A株所特有。

3.2 gI基因

gI基因位于US区，长约1 050 bp，共编码349个氨基酸，是PRV的重要毒力基因。gI基因编码蛋白不仅可在细胞水平发挥其毒力作用，还可促进病毒在神经系统中的增殖，从而影响其神经嗜性。

肖少波等[16]研究发现单独缺失gI或gC基因均可使PRV毒力下降，但双缺失gI和gC基因的重组病毒毒力会大幅下降甚至完全丧失，由此得出结论gI基因可促进或协同其他毒力蛋白发挥毒力作用。研究表明在病毒侵染过程中，gI基因通过促进病毒在神经系统中的复制过程从而影响病毒的神经嗜性[17]。缺失gI基因的PRV虽然可以和野生型PRV一样沿着神经元侵入到神经系统中，但相比于野毒来说，gI基因缺失株感染的神经元数量显著降低。有报道称gI基因编码蛋白在172位缺失1个氨基酸及在238位插入1个氨基酸是PRV突变株的显著特征，林群群等[18]对PRV变异株(NP株)gI基因进行同源性比对分析，结果显示NP株与国外分离株(75V19株、NS374株、Becker株、Kaplan株)相比氨基酸同源性为89.9%～92.3%，与国内PRV分离株(BJ-YT株、Xiang A株、Ea株)相比氨基酸同源性为99.2%～99.5%，其中与国内PRV分离变异株相比氨基酸突变位点主要集中在第165～173位和第236～246位这2个区域，与报道中PRV突变株的显著特征有出入，关于PRV变异株在gI基因上所体现出的突变规律还需更多的相关研究加以归纳总结。

3.3 gE基因

gE基因位于US区，前接gI基因，长约1 734 bp，共编码577个氨基酸。gE基因编码蛋白具有促进细胞融合的作用，在PRV入侵宿主细胞的过程中，gE糖蛋白通过促进感染细胞与非感染细胞的融合，从而介导病毒在细胞水平传播而发挥其毒力作用。此外，gE糖蛋白还与PRV的组织趋向性密切相关，有助于病毒定向扩散至宿主中枢神经系统，在一定程度上决定PRV的嗜神经性[19]。在PR基因缺失疫苗研究中，gE基因常作为缺失致弱的标志基因，临床上常采用gE-ELISA试剂盒检测gE基因的有无从而区分PRV感染类型，即野毒株感染或疫苗株感染。

研究表明gE基因是与其他基因通过共价键形成统一体，以复合物的形式发挥其毒力作用的。Zuckermamna等[20]为了研究gE基因的致病机理，在感染的细胞中运用免疫沉淀法证实gE与gI不但形成gE/gI非共价复合物作为病毒的功能成分，而且可能以一个完整的功能性单位行使其功能，该复合物在促进病毒在细胞间扩散的同时，也涉及病毒从细胞的释放及细胞融合过程[21]。此外gE/gI还可与其他基因进行互作而行使功能：gE/gI/TK相互作用会使PRV的毒力进一步增强；gE/gI/gC相互作用可主导病毒的释放[22]。

gE基因在PRV基因组中相对保守，其本身遗传变异性并不大。覃雨阳等[23]将国内外PRV毒株作为参考毒株，对广西不同地区流行的4株PRV变异株gE基因进行同源性比对分析，研究结果显示4株PRV变异株与广东Fa株、湖北HD株等变异株相比氨基酸和核苷酸同源性分别高达99.8%和99.7%，远远高于与国内经典毒株的同源性，且与变异株广东Fa株、湖北HD株相比，4株PRV变异毒株gE基因的48位均存在1个天冬氨酸插入的情况；赵鸿远等[24]将在吉林和黑龙江发病猪场分离鉴定得到的2株PRV变异株分别命名为JL1株、HLJ1株，对2株变异株的gE基因进行同源性比对分析可知，与经典毒株相比JL1株、HLJ1株核苷酸同源性为96.6%～99.1%；与变异株相比核苷酸同源性为97.1%～99.5%，与变异株表现出较高的同源性，且变异株均存在gE蛋白48位和492位附近各插入1个天冬氨酸的情况，该研究认为此分子特征可用来鉴定PRV毒株变异与否，但是陈超等[25]调用GenBank中多株不同来源的PRV参考毒株与山东省12株PRV流行变异株的gE基因进行序列比对发现，LDZ04-2014株与2012年分离于国内的HBBA2012株的492位并没有天冬氨酸的插入，而分离于2001年的Fa株、2008年的HNJZ等经典毒株的492位却存在2个天冬氨酸的插入，所以gE基因492位天冬氨酸的插入现象并不是变异株所特有的分子特征，早在经典毒株中就存在，因此不能将其作为鉴定PRV毒株是否变异的标准，关于PRV变异株在gE基因上体现出的生物学特性尚需深入研究。

3.4 gB基因

gB基因位于UL区，全长约2 742 bp，共编码913个氨基酸，是PRV的主要毒力基因。gB基因编码蛋白作为PRV病毒粒子的主要结构蛋白，不仅是病毒囊膜的主要成分，还可以诱导机体产生2种中和抗体从而发生特异性细胞免疫和体液免疫反应，此外糖蛋白gB也与PRV感染宿主密切相关，在PRV入侵宿主细胞过程中，首先糖蛋白gC介导PRV病毒粒子结合到宿主细胞表面[26]，调控有糖蛋白gB参与的PRV膜早期融合过程，gD受体结合蛋白再与宿主表面的受体蛋白结合，激发gB和gH/gL二聚体这一核心融合机器发挥作用，使PRV病毒粒子与宿主细胞融合从而完成侵染过程。

gB基因是疱疹病毒属中最保守的糖蛋白基因，在PRV的遗传变异过程中表现出高度保守性。张新平等[27]以GenBank中收录的国内外具有代表性的PRV分离株作为参考毒株，对福建变异株(LY株)gB基因进行同源性比对分析，结果显示LY株与国外参考毒株(Becker株、Bartha株、Kaplan株、SouthKorea株、Japan株)相比氨基酸及核苷酸同源性分别为62.9%～96.4%、74.9%～98.1%；与国内流行毒株Ea株(湖北)相比氨基酸及核苷酸同源性分别为95.8%、98.8%，与国内流行毒株表现出较高的同源性，表明LY株是由国内流行株遗传变异而来；刘志成等[28]通过对广东省2015年分离得到的PRV流行变异株(LC株)gB基因进行分析比对可知，LC株与中国经典毒株(Ea株、Fa株、SC株)相比氨基酸及核苷酸同源性分别为99.1%～99.3%、99.7%～99.8%；与2012年分离变异株(HNX株、HNB株、HN1201株、HeN1株、JS-2012株、ZJ01株、TJ株、HLJ8株)相比同源性分别为99.8%～99.9%、99.9%～100.0%，证明LC株是在PRV变异株的基础上发展而来的。

4 PRV变异株疫苗的研制

疫苗在防控PRV流行的过程中发挥了重要作用。目前国内市场上现有的以经典PR毒株为亲本的基因缺失疫苗主要包括Bartha-K61株、鄂A株、Hb98株、Hb2000株SA215株等，其中以Bartha-K61株为重要代表，Bartha-K61疫苗株缺失了主要毒力基因gE，为gE基因缺失疫苗结合gE-ELISA鉴别诊断方法净化和根除PR提供理论基础。这些疫苗对我国PR的防控发挥了巨大的作用。但是自2011年以后，我国部分地区的猪场免疫过Bartha-K61疫苗的仔猪相继表现出疑似PR的临床症状，新的PR引发的疫情再次暴发流行，并从华北地区开始蔓延至全国，且临床采样结果显示PRV野毒检出率增加。杨涛等[29]将厦门市2017年分离得到的PRV变异株与4个厂家的Bartha-K61活疫苗的免疫原性基因gB、gC、gD进行同源性比对分析，结果显示变异株与Bartha-K61疫苗株相比，在gB、gC、gD蛋白序列中均存在不同程度的差异，在其氨基酸序列基础上建立的进化分析结果表明，PRV变异株与Bartha-K61分属于不同进化分支，从而导致Bartha-K61的免疫保护效力不足以抵抗PRV变异株的攻击。据报道，Bartha-K61对于PRV新流行变异株引起的疫情免疫失败的情况在我国多有发生，新的PR疫情表现为高致病力，高死亡率，流行势头迅猛，因此研制新的针对PR流行变异株的疫苗刻不容缓。

目前，针对PRV流行变异株基因缺失疫苗开展了大量研究。童武等[30]运用同源重组的方法构建了gE/gI双基因缺失的JS-2012株，利用该毒株的灭活疫苗接种1次后免疫仔猪对变异毒株JS-2012的保护率达到60%，免疫2次后保护率达到100%；顾真庆等[9]利用同源重组技术构建了双基因缺失株vZJ01ΔgE/gI，将该毒株制成灭活疫苗，与Bartha-K61对照组共同进行猪体免疫保护试验，结果表明vZJ01ΔgE/gI灭活疫苗可以抵御PRV超强毒株ZJ01株的致死攻击，且免疫效果优于对照组Bartha-K61活疫苗。

基于双基因缺失的三基因缺失苗具有更好的安全性及免疫原性，基本不会有散毒或毒力返强的情况出现。Cong等[31]利用细菌人工染色体技术构建了gE/gI/TK三基因缺失的HN1201株，对猪群持续免疫4周后进行攻毒试验，结果显示该缺失株对免疫猪群的保护率高达100%；胡睿鸣等[32]运用基因工程技术构建了gE/gI/TK三基因缺失的 r SMXΔgI/gEΔTK株，该毒株接种1次后免疫仔猪对变异毒株CH/HNSMX/2012的保护率就可达到100%，且易感动物(小鼠、绵羊、新生仔猪等)经免疫后并未表现出临床症状，表明该毒株安全性良好。吕素芳等[33]在TK基因缺失的质粒pBTK及gI/gE双基因缺失株PRV SA738病毒基因组的基础上，运用脂质体介导法构建了三基因缺失株gI/gE/TK PRV SA738，利用该毒株制成活疫苗首免仔猪42 d后进行攻毒试验，结果表明该三基因缺失株对SA等强毒株的攻击可提供完全免疫保护，且免疫效果优于gE/gI PRV突变株。

诸多临床实践证明基因缺失苗可使免疫猪免受PRV变异株的致死性攻击，可作为有效的候选疫苗，且与传统毒株疫苗相比基因缺失苗具有致病性小，无潜伏感染，安全高效等优势，在对PR的防控方面具有重要意义。截止目前，由我国国家兽用药品工程技术研究中心研制的猪伪狂犬病灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)已于2019年1月取得新兽药注册证书。该疫苗株是在PR变异株(HN1201株)作为母本的基础上缺失gE基因而得到的，对当前PRV流行变异株引发的猪伪狂犬病具有较好的免疫保护效果，且可通过gE-ELISA诊断试剂盒鉴定PR感染类型。

5 PRV感染的防控

PRV多为潜伏感染，即接种疫苗后的康复畜群虽恢复正常生产，但应激后仍会重新激发隐性感染而表现出临床症状，并长期带毒散毒而成为二次感染源，这一特点使该病在猪群中长期循环传播，严重阻碍我国养猪业的发展进程，因此开展猪伪狂犬病防控措施的研究有重要意义。

对于PRV的防控主要应从免疫接种，加强饲养管理和消除传播媒介等几个方面着手。首先要基于猪场具体的检疫情况制定合理的免疫程序，通常以猪场阳性率10%作为临界水平，阳性率高于10%时一般采取密集免疫形式，低于10%时采取一般免疫形式，同时定期对猪群PR阳性率进行监测，并根据监测结果及时调整免疫程序，根据毒株流行情况指导疫苗选择，对于疑似隐性带毒猪要制定合理的免疫方案并严格按照免疫程序执行，同时利用间接ELISA法检测猪群抗体水平，掌握猪群潜伏感染情况，对于阳性猪，隐性带毒猪一律采取淘汰，扑杀的处理方式，从源头上阻断PRV的感染和传播。同时加强饲养管理，基于饲养标准针对猪群制定科学合理的饲养方案，满足机体的营养需求，同时营造干净卫生的饲养环境，对猪舍进行定期消毒以预防病原传播及疫情扩散蔓延，消毒时以2种以上消毒药物交替使用为宜。消除传播媒介对于PRV感染的防控同样重要，规模化养猪场要构建一套适用于猪场自身条件的生物安全体系，根据猪种类的不同实行分群饲养，对进入猪场的车辆和人员进行严格消毒。另外鼠类作为PRV的主要带毒者和传播媒介应给予高度重视[34]。在做好定期灭鼠工作的同时也要注意饲料保存，避免用于投喂的饲料被鼠代谢物污染。

6 小结

近年来由于PRV在基因组水平上发生了新的变异，导致其相比于传统毒株在抗原性以及毒力方面发生较大变化，因此传统疫苗已经不能使猪群完全抵御PR的攻击，研制一种针对当前PRV流行株的新型疫苗就显得极为迫切和必要。

PRV毒力由多基因共同调控，致病机理复杂，目前基因缺失疫苗凭借其显著的优势在控制PR方面表现出了良好的发展前景。因此，今后PR疫苗发展的主要方向还是构建新的基因缺失株从而发展双价或多价疫苗，但致弱PRV在作为构建基因缺失苗技术核心的同时，也引起了一些问题，例如会在一定程度上导致疫苗的保护效果降低等，所以基因缺失疫苗的安全性及免疫效力还需进一步的评价。针对于PRV变异株的疫苗HN1201-ΔgE株疫苗已于2019年获得新兽药证书，相信随着基因缺失手段的成熟及PR防控体系的健全，更多的基因缺失疫苗在不久的将来会应用于临床，为伪狂犬病的区域性净化及全国净化奠定坚实的基础。