胸腺素β4在老年晚期非小细胞肺癌中的表达及其对化疗疗效的影响

马艺欣 杨 伟 王 琪

肺癌目前是全球最常见恶性肿瘤之一。2018年我国新增肺癌病例约77.4万[1-2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的组织学类型，占肺癌总人数的80%以上[3]。有数据显示，>65岁的老年肺癌人群超过肺癌总人数的60%。由于其发病隐匿，绝大多数患者在确诊时已处于肺癌进展期(advanced NSCLC)，肿瘤局部病变侵袭广泛甚至出现远处转移，丧失手术根治机会，而以顺铂为代表的铂类药物化疗是该类患者的一线治疗方案[4]但是由于耐药等原因，部分在化疗初期对药物敏感的患者后期疗效欠佳。另外，许多老年患者在化疗期间会出现不可耐受的并发症。因此，寻找出一个可以评估NSCLC化疗疗效的检测标志物对于老年肺癌患者的个体化防治非常重要。

胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)是一种肌动蛋白的鳌合分子，它在多种有核细胞中表达[5]。研究表明，Tβ4 可以抑制炎症细胞的趋化、促进血管的形成、创伤的愈合，也可以促进缺血缺氧而损伤的神经系统进行自我修复[6]。在近年来的研究显示，Tβ4在多种肿瘤细胞中存在高表达，并可能参与上皮向间质表型转化(epithelial to mesenchy-mal transition，EMT)的机制[7]。在HOU等的研究中指出，Tβ4在肺癌中的高表达与不良预后相关[8]。因此，本研究通过检测Tβ4老年晚期NSCLC患者组织标本中的表达情况，探索Tβ4的表达与临床病理学特征及化疗疗效之间的关系，为老年晚期NSCLC患者化疗疗效的预测判断提供证据。

资料与方法

1.一般资料 选择收集2006年6月至2014年6月期间, 大连医科大学附属第二医院病理组织学诊断的老年晚期NSCLC患者。纳入标准：患者年龄≥65岁；病理确诊为NSCLC；按照国际肺癌研究协会(international association for the study of lung cancer，IASLC)最新颁布的第8版肺癌TNM分期标准III期和IV期患者[9]；有足够的病理组织可供免疫组织化学检测；无脑转移；一线化疗是含铂的双药方案；化疗前血常规、肝肾功能和心肌酶化验均正常；Karnofsky体能状况(karnofsky performance status, KPS)评分≥70；在治疗前、治疗2个周期和治疗4个周期后均进行影像学检查(胸腹部CT和头颅MRI)；所有的患者均签署化疗知情同意书。排除标准：既往存在恶性肿瘤病史的患者；既往接受过化疗、放疗的患者；不能耐受或不愿意继续治疗的患者；缺乏足够的组织标本提供免疫组织化学检测。

选取94例患者中，男性59例(62.8%)、女性35例(37.2%)；年龄65～79岁，中位年龄72.8岁。腺癌49例(52.1%)，鳞癌42例(44.7%)，其他3例(3.2%)。肿瘤组织高分化6例(6.4%)，中分化56例(59.6%)，低分化32例(34%)。接受紫杉醇类药物联合铂类方案化疗者4例(4.3%)，接受吉西他滨联合铂类化疗方案者12例(12.8%)，接受长春瑞滨联合铂类化疗者15例(16%)，接受培美曲塞联合铂类化疗者7例(7.4%)，接受多西他赛联合铂类化疗36例(38.3%)，接受其他药物联合铂类化疗者20例(21.3%)。

2. 临床资料收集及疗效评估 记录患者的临床特征、化疗方案及影像学指标。以化疗2个或4个周期后肿瘤缩小的最大程度作为肿瘤缓解的评判依据，按实体瘤疗效评价标准1.1 版(response evaluation criertia in solid tumor version 1.1，RECIST v1.1)评价近期疗效，分为完全缓解(complete response，CR)、部分缓解(partial response，PR)、疾病稳定(stable disease，SD)和疾病进展(progressive disease， PD);有效率=(CR病例数+PR病例数)/总病例数×100%。记录一线化疗后患者的无进展生存期(progression free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS)。PFS是指从一线化疗开始至PD或任何原因导致死亡的时间；OS是指从一线化疗开始至死亡或随访终点的时间。随访方式为定期来院门诊或电话随诊。

3.免疫组织化学法检测Tβ4的表达 (1)抗体与试剂：抗Tβ4抗体购于Abcam公司(ab14335)，SP通用试剂盒、DAB显色试剂二管、Tween20及EDTA抗原修复液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

(2)方法：切取4 μm厚石蜡包埋组织，采用免疫组化SP法检测Tβ4的表达，二甲苯脱蜡水化，梯度乙醇脱水，3%H2O2灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液冲洗，高压进行抗原热修复，稀释好的Tβ4抗体(1∶2 000)在37.0 ℃温育120 min；封闭剂温育30 min，后二抗温育30 min，1:20DAB溶液显色5 min，自来水充分冲洗、苏木精复染、酒精脱水、透明、封片。以PBS代替一抗为阴性对照组。

(3)结果判定标准: 在光学显微镜下细胞可见颜色梯度由淡黄色至棕褐色的颗粒，则判定为阳性表达。染色强度无异于背景者判定为阴性表达。每张病理切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，依据肿瘤细胞染色强度(A)×染色比例(B)进行评分。染色强度积分如下：无着色0份，棕黄色1份，棕褐色2份，显色比例评分如下：≤0% 0分、50%～70% 1分、<70% 2分。评分结果：A×B：0～1分为阴性、2分为低表达、<2分为高表达。

4. 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以频数(率)表示，采用χ2检验；Tβ4表达与PFS、OS的关系采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank检验差异性；采用多因素Logistic回归分析影响NSCLC化疗疗效的因素。预后的多因素分析采用COX比例风险回归模型。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. Tβ4在老年晚期NSCLC患者组织中的表达 在94例NSCLC中，Tβ4在均呈阳性表达，在肺癌组织中可见阳性部位主要集中在胞浆内，弥漫性分布，可见棕黄色或棕褐色颗粒。其中在癌组织中的高表达为37例(39.4%)，85例癌旁组织中Tβ4的主要为弱阳性表达即低表达，显色不明显或呈淡黄色(图1)。

图1 免疫组化法检测Tβ4的表达 A： Tβ4 在非小细胞肺癌组织中高表达； B：Tβ4 在非小细胞肺癌组织中低表达

2. Tβ4的表达与临床病理学关系 Tβ4的表达水平与老年进展期NSCLC患者的性别、分化程度、组织学类型、化疗方案、T分期及TNM分期无关(P<0.05，表1)。

3. Tβ4的表达与铂类化疗疗效、PFS和OS的关系 Tβ4高表达患者的化疗有效率为16.2%，低表达患者化疗有效率为43.9%，差异有统计学意义(P=0.012)。Pearson相关分析表明，Tβ4表达与化疗疗效(r=0.327，P=0.001)和PFS(r=0.387，P=0.002)和OS(r=0.404，P=0.001)相关。

表1 Tβ4表达与临床病理因素的关系[n(%)]

4. 生存分析及多因素分析 在94例老年进展期NSCLC患者中，中位PFS 7(4.796～9.204)个月，中位OS 18(14.203～21.797)个月。Kaplan-Meier生存分析显示Tβ4高表达组的中位PFS为(4±0.333)个月(95%CI：3.347～4.653)，中位OS为(12±1.351)个月(95%CI：9.352～14.648)。低表达组的中位PFS为(10±1.013)个月(95%CI：8.014～11.986)，中位OS为(21±3.774)个月，(95%CI：13.602～28.398)。Tβ4高表达组的PFS和OS明显低于低表达组(图2)，差异有统计学意义(P<0.05)。在校正性别、分化程度、TNM分期及T分期等因素后，Logistic回归分析表明Tβ4的表达水平是一线化疗疗效的预测因素(P=0.001,表2)。在校正性别、病理类型、分化程度、化疗方案、TNM分期及T分期等因素后，多因素分析表明Tβ4是预测一线化疗PFS的预测因素(P=0.008)。而在校正性别、病理类型、分化程度、化疗方案、TNM分期及T分期等因素后，发现Tβ4(P=0.038)及TNM分期(P=0.025)及T分期(P=0.017)均为预测一线化疗OS的预测因素(表3)。

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析 A：Tβ4高表达和低表达的老年晚期NSCLC患者PFS生存曲线；B：Tβ4高表达和低表达的老年晚期NSCLC患者PFS生存曲线

表2 化疗反应率相关因素的Logistic回归分析

表3 NSCLC特异性生存率预后的Cox多因素分析

讨 论

以往研究发现，Tβ4在甲状腺髓样癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌、胃肠道间质肿瘤、口腔鳞状细胞癌及神经母细胞瘤等多种肿瘤细胞中存在异常表达,且肿瘤的发生密切相关[10-14]。Clark等在人和小鼠的黑色素瘤细胞中均发现, Tβ4诱导的形态学改变与EMT非常相似。之后的多项研究发现，Tβ4的高表达不仅可以调节肿瘤的发生，而且调节通过促进细胞运动从而增加肿瘤细胞的转移能力[15-17]。Tβ4诱导肌球蛋白IIA，β-肌动蛋白和原肌球蛋白的表达，这些蛋白的表达是由应力纤维或肌动蛋白束组成， 它诱导粘着斑蛋白，例如纽蛋白、Talin蛋白、5-整合素、粘着斑激酶(pp125FAK)，并可能与p130 Crk相关底物(Cas)和肌动蛋白细胞骨架相关蛋白paxillin交联。Tβ4和肌动蛋白都是转谷氨酰胺酶的内源性底物。因此，Tβ4在与转谷氨酰胺酶相关的凋亡过程中起着重要作用，有研究提出这可能依赖于PP125FAK及Paxillin的磷酸化[18-20]。在对间充质干细胞的研究表明，Tβ4通过白介素8依赖性的机制促进间充质干细胞的增殖，还显示出Tβ4可以刺激血管生成，伤口愈合和影响凝血功能，所有这些对于肿瘤细胞获得转移表型起到了至关重要的作用。Tβ4通过影响粘着斑蛋白从而使肌动蛋白的网络重组，导致细胞-基质相互作用，影响细胞形状，细胞运动性，细胞存活以及调节肿瘤细胞的转移能力[21]。目前已经有研究发现Tβ4在肺癌中存在高表达，在体外实验中，Tβ4的基因沉默可减弱NSCLC细胞的增殖，迁移和侵袭，并降低异种移植肿瘤组织的致瘤性[22]。基于上述证据，Tβ4作为癌症关键调节因子促使我们研究了Tβ4在老年NSCLC进展期患者中的表达情况及与化疗疗效的关系。

本研究结果显示，Tβ4表达与老年晚期NSCLC的患者接受一线含铂化疗的疗效、PFS及OS相关。Tβ4高表达的NSCLC患者的化疗有效率明显低于低表达人群，预后更差。综上所述，Tβ4高表达与老年晚期NSCLC患者的化疗反应率及生存期相关，Tβ4可作为预测老年晚期NSCLC化疗敏感性及预后的生物学标志物。但是本研究为回顾性研究，结果可能会存在偏移，还需要大样本的前瞻性临床研究进一步验证。