白藜芦醇对急性肺损伤小鼠的保护作用研究

黄晓军 陈茜圆 任卓超 金兴

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性弥漫性肺损伤和进而发生的急性呼吸衰竭。ALI是严重创伤、大面积烧伤和严重感染等患者死亡的主要原因之一，因此，对其防治具有重要的临床意义。尽管已作了大量的实验与临床研究，但ALI的发病机制仍未完全阐明，且迄今尚无安全而有效的治疗药物，目前常以小潮气量保护性机械通气来降低其死亡率。近年来，研究表明氧化应激状态在ALI发病及损伤机制中发挥着重要作用[1-3]。白藜芦醇（resveratrol，RES）是多酚类化合物，主要来源于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物，具有抗氧化、抗自由基作用[4-5]。RES是否可应用于ALI的治疗，目前研究很少，对此本研究进行了ALI动物模型实验，并对其作用机制作了探讨。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒（A044）购自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（KGT0 0100-1）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（KGEMC102a）及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（KGEMC004）试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Gem Premier 3000血气分析仪购自美国GE公司；IX51光学显微镜购自日本Olympus公司；凝胶成像分析系统（SYNGENE G:BOXChemiXR5）购自美国Bio-Rad公司；RES和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）购自美国Sigma公司。

1.2 实验动物分组及模型制作 选取6～8周健康清洁级（Ⅱ级）雄性小鼠30只（由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供），采用随机数字表法分为对照组（C组）、ALI组和RES干预组（RES组）3组，每组10只。RES组给予 RES（50mg/kg体重）灌胃，1次/d，连续 3d。第 4天时，RES组和ALI组腹腔注射LPS 10mg/kg（溶于400μl 0.9%氯化钠注射液）制备内毒素诱发ALI模型，C组腹腔注射同等容量的0.9%氯化钠注射液。6h后配制10%水合氯醛腹腔注射麻醉，再由腹主动脉取血，行血气分析，计算氧合指数（血氧分压/吸入氧浓度），以氧合指数≤300mmHg为ALI模型制备成功的标准[6]。同时下腔静脉取血肝素抗凝，然后处死小鼠，立即从胸腔中取出心肺组织。

1.3 肺组织匀浆收集 取左肺组织，用预冷的0.9%氯化钠溶液在玻璃匀浆器内充分匀浆，制备为10%组织匀浆。取0.45ml匀浆用于测定MPO；剩余匀浆用低温离心机10 000r/min离心10min，收集上清液置于-80℃保存，以备下述检测使用。

1.4 肺组织病理学观察 取右肺副叶肺组织，0.9%氯化钠溶液浸洗后，10%甲醛固定，经梯度乙醇脱水置换，二甲苯透明后，常规石蜡包埋切片，HE染色，Olympus IX51光学显微镜下观察肺组织病理学结果，参照文献[7]介绍的方法进行肺组织病理学损伤评分。每张切片随机选取10个视野进行评分，取其平均值。

1.5 血清TNF-α和IL-6水平检测 按照测试盒说明书，采用ELISA法检测血清促炎因子TNF-α和IL-6水平。

1.6 肺组织MPO、SOD含量检测 按照测试盒说明书，采用比色法检测肺组织MPO、SOD含量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，3组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织形态学变化 ALI组肺组织切片HE染色后，光镜下可见炎症反应，中性粒细胞为主的炎症细胞浸润肺泡间隔、肺泡腔，肺泡腔不规则扩大、肺泡间隔断裂（图1）；RES组上述表现明显减轻（图2）；而C组未见上述反应（图3）。C组、ALI组和RES组肺组织病理学损伤评分分别为（0.74±0.20）、（6.26±0.58）、（3.60±0.52）分，差异有统计学意义（F=315，P＜0.05）。与 C 组比较，ALI组和RES组肺组织病理学损伤评分均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与ALI组比较，RES组肺组织病理学损伤评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 ALI组小鼠肺组织病理切片所见（HE染色，×200）

图2 RES组小鼠肺组织病理切片所见（HE染色，×200）

图3 C组小鼠肺组织病理切片所见（HE染色，×200）

2.2 3组小鼠血清TNF-α、IL-6水平和肺组织MPO、SOD含量比较 与C组比较，ALI组和RES组血清TNF-α、IL-6水平及肺组织MPO含量均升高，肺组织SOD含量均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与ALI组相比，RES组血清TNF-α、IL-6水平及肺组织MPO含量均降低，肺组织SOD含量升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 3组小鼠血清IL-6、TNF-α水平和肺组织MPO、SOD含量比较

3 讨论

近年研究表明，活性氧（ROS）引起的氧化应激状态在ALI的发病机制中起着至关重要的作用[1-3]。过量存在的ROS可超出抗氧化系统的能力，导致氧化与抗氧化失衡，最终引起疾病的发生。在生理情况下ROS是通过细胞内抗氧化反应元件（ARE）调控的相关解毒、抗氧化酶去除和降解的[8]。转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）在驱动ARE调控基因中起重要作用[9-12]。Nrf2是合成内生性抗氧化酶的最主要的调节器，其主要在代谢性器官、解毒器官以及与外界相通的器官中高表达，如肝、肾、肺和肠等[13-14]。正常生理状态下，Nrf2定位于细胞质，与胞质接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）形成复合物，使Nrf2的含量维持在较低水平。当机体存在氧化应激反应时，Nrf2磷酸化并从Keap1蛋白上解离出来，随即活化转位进入细胞核结合到ARE上，启动其下游多个抗氧化基因及解毒酶等的转录翻译，来对抗氧化应激[15]。其中抗氧化蛋白酶类基因是这些保护性基因中非常重要的一类，如SOD是体内最重要的氧自由基清除剂。

RES主要来源于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物，具有很强的抗氧化、抗自由基作用。已有研究发现RES在一些高氧化应激疾病中的保护作用。Sebai等[16]研究发现RES能抵消LPS所导致的肾脏血流动力学改变，可减少脂质过氧化物，增加SOD、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性，减少血浆和尿中一氧化氮水平。Zhang等[5]在RES对无机砷暴露所致肝损伤的保护作用的研究中发现，与三氧化二砷处理组比较，RES预处理组保护了抗氧化酶SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，抑制了三氧化二砷诱导的细胞内ROS的增加，降低了丙二醛（MDA，脂质过氧化的终产物，可用于监测氧化损伤的指标）。Wang等[17]在RES对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠炎症和氧化应激的影响的研究中发现，与COPD组比较，RES治疗组肺部小气道炎症减轻，MDA、血清IL-6和IL-8水平降低，SOD活性增加。

本研究结果显示，RES干预可使LPS诱导的ALI小鼠肺组织抗氧化酶SOD升高，氧化应激损伤指标MPO降低，肺损伤评分降低，同时使血清中炎症指标TNF-α和IL-6水平降低，对ALI起到保护作用。

综上所述，RES可通过抗氧化应激及清除氧自由基相关物质，从而对LPS诱发的ALI小鼠起到保护性干预作用。本实验只简单探讨了RES在ALI中起到的保护作用，其具体的作用机制及是否具有激活Nrf2与Nrf2/ARE通路共同作用干预ALI的发生和发展有待进一步探讨。