不同碱度和ɑ-酮戊二酸水平对松浦镜鲤肠道形态及消化酶活性的影响

程龙，彭丰，李晋南，徐奇友，王连生

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070;2.上海海洋大学水产与生命学院，上海2 013063）

碱度为重要环境指标，显著影响鱼类的生长。鱼类对碱度的耐受具有一定范围，高碳酸盐碱水环境对鱼类有毒害作用[1]。Galat 等[2]研究发现，随着碱度的增加，鲑鳃上皮细胞分离或破裂，氯细胞增生肥大，肾小球突起及肾小球或造血组织中出现无色透明小液滴等症状。王萍等[3]分析了青海湖裸鲤Gymnocypris przewalskii 碱胁迫后肠的排泄物，发现盐度、碱度及湖水胁迫等均可引起肠道大量排出HCO3-离子，表明肠道在调节裸鲤体内渗透压中具有重要意义。但碱胁迫对鱼类肠道形态的影响还没有相关的研究。碱度过高显著影响鱼类消化酶的活性，水环境碱度过高一般会降低鱼类的消化酶活性和摄食水平、饵料利用率及生长。袁玉仁[4]研究表明，碱度高于10mmol/L 时花鲈Lateolabrax japonicus 消化酶活性明显降低；随着碱度的升高以及试验时间的延长，对花鲈消化酶活性的降低程度更为明显。主要原因是水环境碱度的提高使消化道pH升高，当pH 超过消化酶最适区域时，消化酶的活性下降[5]。

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）是生物体三羧酸循环中连接碳代谢和氮代谢的重要中间产物[6]，也是合成谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等氨基酸的前体。目前，AKG 对仔猪[7,8]、肉仔鸡[9]以及杂交鲟[10]等动物生长、肠道发育和肠道抗氧化能力等已有大量研究，表明AKG 在促进陆生或水产动物受损肠道的修复，保持肠道组织形态完整性中起重要作用。李晋南等[11]研究表明，AKG 可以明显提高松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu 肠道肌层厚度以及皱襞高度，明显增强肠道消化酶的活性。但在饲料中添加AKG 能否有效降低碱度胁迫对鱼类消化系统的影响还没有研究。本试验在不同碱度水环境下，给松浦镜鲤分别投喂含有1%AKG 和不含AKG的饲料，以探究不同碱度条件下松浦镜鲤肠道形态与功能变化，及水体碱度与饲料中AKG 的添加对松浦镜鲤肠道形态与功能的影响，为盐碱水养殖实践中AKG 的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

AKG（纯度≥98.0%）购自Sigma 公司；松浦镜鲤幼鱼购自黑龙江水产研究所呼兰实验站。

根据《鲤鱼配合饲料》（SC/T 1026-2002）以及NRC（2011）要求，以进口蒸汽鱼粉及豆粕为蛋白质源，以豆油、鱼油、大豆磷脂为脂肪源，配制等氮等能基础饲料（表1）。用AKG 替代基础饲料中的葡萄糖，配制成含有1%AKG 和不含AKG 的2 种试验饲料。饲料原料粉碎后过80 目筛，按表1 配方称重后将各原料逐级混合均匀，加入一定量的水，充分混匀后经小型制粒机加工成粒径为1mm 的颗粒饲料，常温风干后于4℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及饲养管理

本研究，养殖水体共设15mmol/L 和30mmol/L 2个碳酸盐碱度和1 个淡水对照组（0mmol/L），每个处理组3 个平行。用NaHCO3（分析纯）配置相应的碱度，用0.02mol/L 的盐酸标定，甲基橙-苯胺蓝（混合）和酚酞作指示剂[12]，实测碱度分别为14.85 mmol/L和29.22mmol/L。

养殖试验前彻底清理鱼缸并消毒。实验鱼用4%食盐水消毒，驯化2 周后，挑取540 尾初始体质量为（6.66±0.03）g 规格相近的镜鲤幼鱼，随机分为6 组，每组3 个平行，每个平行30 尾鱼，养殖8 周。试验期间光照均匀，每天换水20%并定期清洗鱼缸，保持水质良好，使用经曝气处理的自来水配制不同碱度的试验用水，水温（23±0.5）℃，溶氧大于5.0mg/L，氨氮小于1.0 mg/L。试验期间，每天7:30、12:30 和16:30 投喂3 次。

1.2.2 肠道形态指标的测定

养殖试验结束时，每缸随机取出3 尾鱼，用100mg/L MS-222 麻醉后，置于冰盘上解剖，取出内脏并分离肠道，剔除肠道表面附着的脂肪及肝脏组织，用预冷的0.86%生理盐水清洗肠道后用滤纸吸干，截为前肠、中肠、后肠三段（前肠为肠道第一个回折之前的部分，中肠为第一个回折到最末一个回折的部分，后肠为最末回折处至肛门的部分）。取长度为1cm 左右的肠段固定于Bouin 氏液中，切片。采用Motic 显微图像系统（Motic Images Plus 2.0 软件）测量每个切片中6 个以上完整肠道皱襞高度、绒毛宽度及肠道基膜厚度（μm，成像倍数为10×100），取其平均值。

1.2.3 肠道消化酶活性的测定

实验结束时按照上述方法截取肠段，准确称取肠道组织重量，按质量体积比1∶9 与预冷的0.86%生理盐水稀释，采用FJ-200CL 高速匀浆机冰浴匀浆，按照试剂盒要求的离心速度和时间进行离心，离心后取组织上清液，分装后于冰箱（-20℃）中保存，用于测定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性。蛋白酶活性采用福林-酚（Folin-phenol）法测定；脂肪酶及淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书测定。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准误表示，SPSS19.0 软件分析。以不同碱度水平和AKG 浓度为影响因素，采用双因素方差分析进行统计，用Duncan's 检验数据的显著性，差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同碱度和AKG 水平对镜鲤肠道形态的影响

由表2 可知，碱度胁迫下，镜鲤中肠的绒毛长度均低于淡水组（P＜0.05），随着碱度上调，中肠绒毛长度变短；后肠的绒毛长度同中肠绒毛长度呈相同的变化趋势，差异不显著（P＞0.05）。碱度胁迫使中肠绒毛宽度显著降低（P＜0.05）；碱度和AKG 水平对前肠、后肠绒毛宽度无显著影响（P＞0.05）。碱度和AKG 水平对前、中、后肠的基层厚度无显著影响（P＞0.05）。双因素方差分析显示，碱度和AKG 对肠道形态的影响均没有交互作用。

2.2 不同碱度和AKG 水平对镜鲤肠道消化酶的影响

由表3 可知，碱度胁迫使镜鲤前肠淀粉酶活性显著降低（P＜0.05）；淡水组中，添加AKG 也显著降低了前肠淀粉酶活性（P＜0.05）；而在15mmol/L 碱度水平下，饲喂添加1%AKG 饲料时，镜鲤的前肠淀粉酶活性显著提高（P＜0.05）；碱度和AKG 水平对前肠淀粉酶活性有交互作用（P＜0.05）。碱度胁迫下，前肠、中肠的蛋白酶活性显著降低（P＜0.05）；低碱度条件下（0 mmol/L、15 mmol/L 碳酸盐碱度），添加AKG提高了前肠和中肠蛋白酶的活性，但差异没有达到显著水平（P＞0.05）；碱度和AKG 水平对中肠蛋白酶活性有交互作用（P＜0.05）。随着碱度水平提高，前肠、中肠脂肪酶活性显著降低（P＜0.05）；淡水组中，添加AKG 显著降低了中肠脂肪酶活性（P＜0.05），但碱度和AKG 水平对肠道脂肪酶活性无交互作用（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 不同碱度和AKG 水平对镜鲤肠道组织形态的影响

松浦镜鲤为无胃鱼类，其肠道形态结构的完整性对营养物质的吸收更为重要。鱼类肠道的许多皱襞是增加肠道表面积的关键因素；绒毛长度和宽度以及基层厚度等指标可直接反应皱襞形态，是反映水生动物肠道形态和吸收能力的重要标志[13]。水环境中的胁迫因子显著影响鱼类的生长发育，氨氮和亚硝酸盐胁迫的研究已较为深入[14,15]。水体中氨氮含量升高可导致鲤肠绒毛上皮充血、融合及固有层细胞坏死等病症[16]；pH 和碱度的升高也会导致鲤毒性，甚至死亡[17,18]。本试验中，碱度升高降低了中肠的绒毛长度，且碱度越大，中肠绒毛长度越短；后肠的绒毛长度同中肠绒毛长度呈现相同的趋势，但差异不显著，且碱度胁迫还使中肠绒毛宽度增加，其原因有待进一步研究。AKG 为谷氨酰胺的前体物质，外源添加可以代替部分谷氨酸和谷氨酰胺；AKG 在溶液中具有良好的稳定性，能克服谷氨酰胺易降解的缺点[19]，提高肠道对其的吸收能力。已有研究表明，AKG 的添加对镜鲤肠道形态具有积极作用[11]。本试验中，与对照组（0mmol/L 碱度，0%AKG）组相比，淡水组添加1%AKG 的镜鲤中肠绒毛长度显著增加，这可能是因为AKG 可以为肠道上皮细胞提供能量[8]，促进上皮细胞增值[20]，促进肠道细胞的生长发育。碱胁迫下，饲喂添加AKG 饲料的镜鲤前肠绒毛长度均高于对照组，而中肠绒毛长度中并没有相似的效应。双重比较也表明，碱度和AKG 水平对肠道组织形态无交互作用。

3.2 不同碱度和AKG 水平对镜鲤肠道消化酶的影响

肠消化酶活性决定鲤对营养物质的消化吸收能力，影响鲤的生长发育。pH 对鱼类消化酶活力具有一定的影响，一般随pH 的升高消化酶活力呈现先升高后降低的趋势[21,22]。水体碱度和pH 对鱼类损伤具有协同作用[12,23]。本试验中，碱度环境显著抑制了镜鲤的消化酶活性，这种变化也与碱度环境的胁迫有关。王萍等[3]分析碱胁迫下青海湖裸鲤Gymnocypris przewalskii 肠道排泄物，发现碱胁迫使裸鲤肠道大量排出HCO3-离子。这些离子的存在可直接提高肠道内pH，一般pH 过低或过高都会直接改变酶的构象，影响酶与底物的结合和酶活性[24]。位莹莹[25]研究发现：饲料中添加AKG 显著影响松浦镜鲤肠道消化酶（如蛋白酶）活性，促进了肠道蛋白吸收；陈迪[10]等研究表明，添加AKG 可显著提高鲟肠道蛋白酶活性。本试验中，低碱度条件下（0 mmol/L、15 mmol/L 碳酸盐碱度），日粮中添加1%AKG 提高了前肠和中肠蛋白酶活性，但效果不显著；15 mmol/L 碱度水平下，饲喂添加AKG 饲料使实验鱼的前肠淀粉酶活性显著上升；碱度和AKG 水平对前肠淀粉酶以及中肠蛋白酶活性均有交互作用；添加AKG 也有降低试验鱼前肠、中肠脂肪酶活性的作用，但碱度和AKG 水平对肠道脂肪酶活性均无交互作用。此结果与魏玉强[26]研究结果中，添加1.5%AKG 可显著提高镜鲤前肠和中肠蛋白酶和脂肪酶活性的部分结果相同，不完全相同的原因可能与镜鲤的生长发育阶段有关。

综上所述，水体碱度胁迫可影响松浦镜鲤中肠绒毛的发育并降低消化酶活性，且随着碱度上调，中肠绒毛长度及前肠、中肠脂肪酶活性显著下降。饲料中添加AKG 可显著提高肠道淀粉酶及蛋白酶活性，对改善碱度胁迫下松浦镜鲤消化功能具有一定的作用。