常规RT-PCR快速检测诺如病毒方法的建立

曲 莉，王洪艳，李 环，母润红，王艳双

(北华大学医学院，吉林 吉林 132013)

诺如病毒(Norovirus，NOV)属于嵌杯病毒科诺瓦克样病毒属，是一种单链RNA病毒，人和动物感染后可引起急性胃肠炎，根据其病毒的RNA聚合酶和衣壳蛋白核苷酸序列分为5个基因型，其中，GⅠ、GⅡ和GⅣ基因型主要感染人类，GⅠ、GⅡ型诺如病毒引起人类感染急性胃肠炎较多见[1-2].目前针对诺如病毒的检测方法有电镜法、免疫学法、分子生物学法.电镜法检测的灵敏度较低，免疫法的特异度有待提高，分子生物学检测方法主要以反转录(RT)-PCR为主，RT-PCR通过对病毒目标基因片段进行扩增检测，其灵敏度和特异度较好[3].对诺如病毒的保守区域进行引物设计，如ORF1-ORF2[4]连接处、RNA聚合酶区域[5]是检测诺如病毒理想的引物设计区域[6-7].本实验主要针对RNA聚合酶区域进行引物设计，该区域特异性较好，有利于提高检测的灵敏度和特异度.诺如病毒感染人类后，其免疫保护时间短，传播途径多样，人群普遍易感染，具有高度感染性和快速传播的特点，所以加强对诺如病毒的检测，建立灵敏度、特异度高的检测方法，将有利于疾病的预防和控制.

1 材料与仪器

1.1 材 料

GⅠ、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒(由吉林省疾控中心赠送).

1.2 主要试剂和仪器

反转录试剂盒(Thermo公司，美国)；DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司)；2xTaq PCR Master Mix(上海天根生物技术公司)；琼脂糖、PBS(GIBCO公司，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)；紫外凝胶成像分析仪(Biorad公司，美国)；9700PCR扩增仪(ABI公司，美国)；DYY-8B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂).

2 方 法

2.1 RT-PCR方法的建立

2.1.1 反转录

病毒RNA反转录及cDNA的合成：用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录，具体步骤：将无核酸酶PCR管放置在冰面上，加入模板RNA引物无水酶至总体积12 μL.65 ℃水浴5 min，转至冰上；5×缓冲液4 μL、RNA酶抑制剂1 μL、10 mmol的dNTP混合物2 μL、M-Mul VRT 1 μL，轻轻混匀，短暂离心.用随机片段引物合成cDNA，25 ℃水浴5 min，42 ℃水浴60 min.终止反应温度达到70 ℃，5 min.

2.1.2 引物设计

针对诺如病毒的聚合酶(RdRp)区，采用primer3在线设计引物(上海生工生物工程有限公司合成).引物序列见表1.

表1 常规RT-PCR应用的引物Tab.1 Primer sequence of conventional RT-PCR

2.1.3 PCR扩增及产物检测

本实验的PCR体系为25 μL，其组分：2×Taq PCR Master Mix 12 μL，上下游引物各1 μL，模板2.0 μL，用灭菌双蒸馏水补足至25 μL.PCR的反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃ 延伸30 s；共30个循环，72 ℃最终延伸5 min.

PCR产物检测：将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上鉴定，电压为60～80 V，20 min，经紫外光线检测拍照.

2.2 灵敏度实验

用紫外分光光度计对阳性GⅠ、GⅡ型诺如病毒的RNA进行定量，调整至相同浓度后，以10倍梯度系列稀释病毒液，运用建立的RT-PCR对100、101、102、103、104、105拷贝/μL的GⅠ、GⅡ型诺如病毒进行检测，分析实验的灵敏度.

2.3 特异性实验

对GⅠ、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测，验证其特异性.

3 结 果

3.1 PCR鉴定结果

通过对诺如病毒的RNA聚合酶区域进行引物设计，通过反复梯度PCR实验，最终确定退火温度60 ℃，在该条件下，可以得到GⅠ、GⅡ型诺如病毒目的基因片段.

3.2 灵敏度结果

105、104、103拷贝/μL的GⅠ、GⅡ型诺如病毒均扩增出相应的目的条带，即最低检测限为103拷贝/μL时，对GⅠ、GⅡ型诺如病毒的检测具有较好的灵敏度.见图1.

3.3 特异性结果

GⅠ、GⅡ诺如病毒分别在162 bp和111 bp出现目的基因片段，诺如病毒亚型间无交叉反应，与轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒同时检测均无目的条带扩增，说明该方法具有良好的特异性.见图2.

4 讨 论

诺如病毒是引起秋冬季托幼机构及学校等人群密集场所急性胃肠炎暴发的主要病原体之一，具有高度传染性.据报道，美国95%的非细菌性胃肠炎是由诺如病毒引起的[8]，在我国的广州[9]、北京[10]、天津[11]等地，诺如病毒也是引起急性胃肠炎特别是婴幼儿急性腹泻的主要病原体.由此可见，诺如病毒是全世界引发非细菌性胃肠炎暴发的主要病原体，可引起严重的公共卫生问题.诺如病毒属于单股正链RNA病毒，容易发生变异，存在多种型别，GⅠ、GⅡ型诺如病毒其基因型可以分为14和17个基因型[7].因此，建立针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒操作简单、重复性好、特异性强的检测方法尤为重要.

本研究应用基于核酸扩增的PCR技术进行诺如病毒的检测，设计区分度高、特异性好的引物是关键.在目的基因的选择上针对其RNA聚合酶区域自行设计引物，该区域是诺如病毒不同基因型较为保守且特异的区域[5]，扩增162 bp和111 bp长度序列，适用于快速检测和今后定量实验.在退火温度的选择上，经过反复梯度温度实验摸索，将退火温度确定为60 ℃，在该温度下，双重引物PCR体系目的基因条带清晰.灵敏度实验结果显示：该方法的最低检测限为103拷贝/μL，作为常规PCR该检测限灵敏度较高.该方法的引物对诺如病毒显示出很好的特异性，GⅠ、GⅡ型诺如病毒间无交叉反应，在与轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒同时进行检测时，能与其他常见腹泻病毒区分开.

诺如病毒基因型复杂，目前不能进行细胞培养，但在外界存活能力强，致病量低，较低病毒浓度即可引起感染，人感染后可引起急性胃肠炎[5].本研究成功建立常规RT-PCR方法及反应体系，稳定快速的扩增GⅠ、GⅡ型诺如病毒目的基因片段，而且片段大小适用于荧光定量检测，为今后荧光定量实验奠定了基础.此外，该方法对突发公共卫生事件中GⅠ、GⅡ型诺如病毒的快速检测具有较好的应用价值.

致谢：本文是国家级大学创业训练项目(201811923016)研究成果的一部分，医学院2015级林国娇、符钧朝、张嘉溪参加了本实验研究工作.