基于STM32芯片的肿瘤细胞荧光检测系统设计*

纪春阳， 徐秀林

(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093)

1 引 言

恶性肿瘤是目前严重威胁人类健康和生命的疾病之一[1]，全球癌症的新发病例预计在2030 年将增加到 2 220万例[2-3]。近年来, 随着医疗技术的不断突破，癌症死亡率保持了逐年下降的趋势[4-5]，这与对癌症的早期检测意识的提高是密切相关的。

通过早期筛查诊断，能显著增加癌症治愈的机会。目前临床上常用的检查方法是活体组织检查及影像学筛查，前者常常花费大量的时间和经济成本，而影像学检查的准确性会受到图像质量和放射科医师专业知识的影响[6-7]，使得患者常常错过最佳治疗时间。因此，如何将现代科学技术的研究成果与医学检查和诊断有效结合，是研究人员急待解决的问题。

2 系统整体结构设计与实现

本研究开发了一种基于微流控芯片的肿瘤细胞荧光检测系统，下位机电路由STM32芯片及外围电路组成，上位机软件系统基于VC++平台搭建。微流控芯片(见图1)的基本结构由玻璃基板与PDMS(聚二甲基硅氧烷)层组成[8]，可实现对样本血液中的肿瘤、红、白细胞的分选[9-10]，本研究使用的芯片内部管道宽度为340 μm、高度为100 μm，借助微流控芯片精密微通道使肿瘤细胞依次流过检测区域。

2.1 光路结构设计

本研究的光路结构采用反射式共焦距结构，选择光强可调式LED作为激发光源。激发光先由滤光片进行固定波长筛选，再由透镜对其进行初次聚焦，二向色镜起到了折射的作用，使激发光充分地投射到待检测物上。当入射光照射在被荧光染料标记的肿瘤细胞时，使细胞表面的荧光素中，原本处于基态的原子向激发态进行跃迁，产生比入射光波长更长的荧光，激发光最终被光电探测器采集。光路示意图见图2(a)，光路实物图见图2(b)。

图1 微流控芯片

图2检测系统光路结构

(a).光路示意图;(b).光路实物图

Fig.2Optical path structure of detection system

(a).optical path diagram;(b).optical path physical map

2.2 电路设计

图3电路结构图

Fig.3Circuit structure diagram

2.3 软件设计

为使检测系统实现可视化与检测结果的录入，本研究同时设计了一套基于VS2015平台、Duilib框架的可视化软件系统。软件系统由患者信息管理模块、肿瘤细胞检测模块和打印报告模块组成。

患者信息管理模块的功能包括：患者信息录入、查看、修改、删除；肿瘤细胞检测模块将下位机采集到的数据，经处理之后进行显示、并绘制成曲线图，以便直观地观测肿瘤细胞的检出率及统计结果。最后将操作人员、患者信息、检测时长、肿瘤细胞数量统计后打印病理报告，以辅助医生诊断。

3 细胞荧光信号采集与电路设计

3.1 光电转换模块

光电倍增管(PMT)通常用于捕捉微弱发射源产生的低光信号，在本研究中，PMT用于探测被荧光标记的肿瘤细胞所激发的微弱荧光信号。在型号选择方面，参照了光谱响应范围、光辐射灵敏度、噪声、阳极脉冲上升时间等技术参数，选择索雷博公司生产的PMT1002光电倍增管模块。该型号探测器响应光辐射响应频段为(230～920) nm，并在630 nm处达到峰值。噪声在0.6 mV左右，该模块在响应时输出在(-1.5～+1.5) V，可将该微弱噪声忽略不计。阳极脉冲上升时间为0.57 ns，可适用于常规检测平台的高速细胞流道，有效避免细胞漏检等情况的发生。光电转换模块内部结构见图4。

图4 光电转换模块内部结构图

Fig.4Internal structure diagram of photoelectric conversion module

3.2 STM32F103C8T6芯片

STM32主控模块采用32位微处理器芯片STM32F103C8T6，ARM Cortex-M3内核作为中央控制芯片。在额定工作状态下，该芯片具有超过80个高速GPIO口对电压和电流分辨率分别为0.8 mV和1 nA，内置I2C通讯接口实现了与A/D芯片通信桥梁，并且与上位机通信使用的串口最高传输速度可达4.5 Mbps，可满足肿瘤细胞荧光检测的准确性与实时性要求。

3.3 A/D转换

ADS1115是一款兼容I2C的16位高精度低功耗的数模转换器。该芯片最高转换速率达到每秒860个数据，并且该芯片内置了多路复用器 (MUX)，实现两次差动输入测量或四次单端输入测量。

A/D转换过程如下：

芯片首先上电并初始化，在接收模式下，收到主机发送的第一个8位start指令后，将R/W位置0进入写模式，配置指定寄存器并应答转换寄存器的LSB、MSB。执行确认指令(ACK)，当指令通过完整性检查后，对寄存器地址指针进行解码，芯片进入待机状态，等待主机下一次start指令。

A/D芯片确认寄存器位置后将数据写入。如果待读取寄存器不是刚刚完成写入的寄存器，则需对下一次指令中地址指针的数值进行修改。

本文认为，不同程序中不同的价值导向在起最终的作用。在专利授权程序中，权利要求理解的价值导向在于：促使专利申请人修改申请文件从而以更加明确的措辞或术语来限定其保护范围。在专利确权程序中，权利要求理解的价值导向在于：既要考虑授权权利要求的公示作用，又要考虑其实际技术贡献，从而更好地在保护专利权人的创新与由权利要求公示作用所体现的保障公众合法权益之间维持平衡。在专利民事侵权程序中，权利要求解释的价值导向在于：对一项具有技术贡献的发明匹配合理的保护范围从而作出侵权与否的判断。不同的价值导向使得不同程序中权利要求保护范围的理解和解释的基本规则不尽相同。

接收到主机发送start指令后，将R/W位置1进入读模式，依次读取数据的高八位与低八位，并将高位右移八位组成16位的数据结果。此时一次转换完成。A/D转换电路见图5。

图5A/D转换电路图

Fig.5A/D conversion circuit diagram

3.4 串口通讯模块

串口模块核心结构由平衡驱动器和差分接收器构成，使其数据最高传送速率达到10 Mbps且具有抗噪声、高共模抑制比的特点。但其接口处易产生电流震荡，需外接电压调置电路才能使其稳定工作。

本研究使用美信公司生产的MAX232芯片作为电压调置电路的核心器件，+5 V循环充电的外接电容用于稳定输出电压。串口通讯电路见图6。

图6 串口通讯电路图

Fig.6Serial communication circuit diagram

3.5 供电模块

供电芯片选择ASM1117-3.3 V和ASM1117-5.0 V两种，二者均由奥地利微电子公司生产。该稳压芯片在-40～125℃时可保持正常工作，满足设备在长时间与非常温环境下的细胞检测需要，并且其输出电压误差不超过1%。

在实际工作中，输入电源通常夹杂一些高低频干扰。为消除噪音影响，在芯片输入、输出端并联两个47 uf电解电容与0.1 uf瓷片电容。前者具有大容量、高交流阻抗的特点，但其对高频噪声抑制效果不明显，而后者高频特性好、容量较小，为更好地消除高低频噪声与降低ESL(串联等效电感)、ESR(串联等效电阻)，将二者搭配使用，使电路系统处于更加稳定的工作状态。供电模块见图7。

图7 供电模块电路图

4 系统软件设计

4.1 患者信息管理模块

患者信息管理模块采用VC++开发，数据库为Microsoft关系型数据库sql server 2005，可将数据文件、数据日志进行简单加密，对患者隐私、诊疗方案进行保密处理。使用ado的方式连接到VC++，实现了对患者信息数据的跨平台调用。

在VC++开发环境中，首先新建用于链接ado的类，将生成的头文件adosql.h、源文件adosql.cpp、msado15.dll动态链接库导入到主程序中。创建指向数据库的指针(m_pConnection)，初始化指针使其指向SQL数据库中的患者信息表(paient)。为了跨平台对数据的读取与修改，将许可权参数设置为默认状态(adModeUnknown)。

4.2 报告打印模块

本研究的报表使用书签与光标混合的形式进行编辑，有效避免串位、乱码等情况的发生。导入word类库，从office 2016安装路径中找到MSWORD.OLB文件，导入_Application、 _Document、Range、Cell等类。为方便在软件系统中实现报表生成，提前在word中创建好一个模板，并在需要填入、更新的位置插入书签。系统使用OLE技术(对象连接与嵌入)实现了对Word文档连接。报告打印预览见图8。

图8 报告打印预览图

5 实验分析

将异硫氰酸荧光素(FITC)[11-12]对人乳腺导管癌细胞系MDA-MB-453进行荧光标记，每次实验取5 mL浓度为1×102Cell /mL的细胞溶液作为试验的样品。为确保FITC染色效果的稳定性与有效性，实验前在荧光显微镜下观察激发荧光效果。图9为 FITC 荧光标记后的MDA-MB-453 细胞悬浮液的荧光激发效果图。为验证采集荧光标记细胞的准确计数功能与探究不同进样速度对检出率的影响，将磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)与不同进样速度作为实验对照组。打开光源、检测电路、光电倍增管上电并将微流控芯片放置在光探头检测窗口区域。设置好检测参数后，微量进样注射泵将样品以4、6、8 mL/h的速度将细胞液注射入微流控芯片中。为验证该检测系统的稳定性，在第一组实验结束后，间隔3 d后按照以上步骤重复进行实验。本实验共进行2组实验，为避免重复性实验中的干扰，在每次实验结束后，使用PBS缓冲液反复对微流控芯片进行清洗，确保无残留肿瘤细胞。实验结果见表1。

表1 肿瘤细胞检出率结果

检出率为实际被检出的细胞数量与应该被检出的细胞个数的比值。由实验结果可知，各组平均检出率为85.36%、85.85%、85.65%、85.06%、70.56%、71.68%，且组内相关系数均高于0.80。对照组实验结果表明，在保证检测精度的同时，最大地提升检测速度，可将进样速度设置为6 mL/h。

图9FITC染色 MDA-MB-453激发效果图

Fig9Excitation effect of FITC dyeing MDA-MB-453

6 结论

本研究开发了一种基于微流控芯片的肿瘤细胞荧光检测系统。该系统的光路结构采用反射式共焦距结构，有效利用激发光源的同时降低杂散光的影响；光电探测器内置跨阻放大器与DAC调制的光电探测器精准探测与采集荧光信号；A/D高精度数模转换器ADS1115在高效转换模拟信号的同时，也对其进行降功耗处理；在多个供电处外接电解电容与瓷片电容，以消除高低频噪声，使电路系统处于稳定的工作状态。

但本研究还存在以下不足之处：当光电探测器探头与待检细胞的距离产生微小变化时，便会对检测结果产生较大影响。本研究中的光学检测平台为手动调节结构，应设计成固定结构或添加镜头位移调整装置，使每次工作时，光电探头自动移动到固定检测位置。因肿瘤患者血液样本获取难度较大，同时血液中成分复杂，本研究使用稀释过的人乳腺导管癌细胞系MDA-MB-453溶液作为模拟血液。为了进一步验证本研究的可靠性，应使用肿瘤患者循环血作为研究样品。本研究中样品荧光标记方式为免疫荧光标记，即抗原抗体反应，但在研究过程中，被标记的肿瘤细胞经微流控芯片离心、富集、筛选过后，表面抗原的脱落现象会对研究结果产生影响，因此可改为荧光酶标记质粒法。