miR-133a对急性心肌梗死的早期诊断及预后评估价值

唐冬娟，薛晓梅，何 斌

上海交通大学医学院附属新华医院麻醉与重症医学科，上海 200092

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠状动脉粥样硬化性心脏病[冠心病（coronary artery heart disease，CHD） ]中较为严重的疾病之一。在过去的几十年里，AMI的发病率和死亡率呈显著上升趋势且日益年轻化[1-2]。研究[3]显示，早期诊断和治疗可显著降低AMI的死亡率，改善患者的远期预后。临床上常采用心肌损伤标志物肌钙蛋白（troponin I，cTnI）对AMI患者进行诊断，但近年来cTnI的灵敏度和特异度备受质疑。相关研究[4]显示，cTnI需在胸痛发作4～12 h才能在血清中被检测到。即使是灵敏度和特异度均较高的高敏肌钙蛋白，对其进行检测也需在胸痛发作3 h之后[5]。另有研究[6-7]显示，cTnI在严重心力衰竭、心房颤动等心脏疾病以及慢性肾病、严重脓毒症和感染性休克等非心脏疾病中的表达量均有所增加。因此，寻找灵敏度和特异度更高的新型生物标志物实现对AMI的早期诊断，已成为临床工作中亟需解决的问题。

多项研究[8-9]证实，miRNA与CHD的生理、病理发展有关，且在血浆或其他体液中具有良好的稳定性[10]，便于检测。部分研究[11-13]表明，某些miRNA具有心肌细胞特异性，如miR-1、miR-133a、miR-208、miR-499等，有望成为心血管疾病的新型生物标志物。已有研究[14-16]发现，在AMI早期（6 h内）多种miRNA出现高水平表达，如miR-133a，故被认为可能是AMI早期诊断的生物标志物。某些miRNA与冠状动脉狭窄的严重程度有关[17]，即循环中的miRNA表达水平越高则血管狭窄程度越严重，且血液循环中miRNA水平可能影响AMI患者的死亡率及1年生存率[18]。但鲜有同时针对心肌细胞特异性miR-133a在AMI的早期诊断、冠状动脉狭窄程度及预后中的潜在应用价值的评估。

基于此，本研究通过检测紧急胸痛患者血清中miR-133a的表达水平，对其作为诊断AMI的生物标志物的潜力以及与冠状动脉狭窄程度、30 d内心血管不良事件发生率的相关性进行评估，以期为AMI的早期诊断和预后评估提供更多的临床证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象及资料收集

本研究纳入2018年7月—2019年5月于上海交通大学医学院附属新华医院因胸痛紧急（6 h内）就诊的90例患者。根据《2015急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南》和《2015 ESC NSTE-ACS指南》，患者被分为AMI组（63例）、不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UAP ）组（13例）和对照组（包括主动脉夹层、心力衰竭、稳定型冠心病、反流性食管炎、低钾等，共14例）。入组标准：①胸痛。②年龄＞18岁。排除标准：①近期已接受过紧急冠状动脉溶栓、支架植入或搭桥手术。②处于妊娠期和哺乳期。③患有精神障碍。④正在使用其他试验性药物。

本临床试验的实施遵循《赫尔辛基宣言》、中国相关法律法规和临床试验机构伦理委员会的意见，已获得上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会审批（审批号：XHEC-C-2016-023-2），并通过了clinicaltrial.gov审核（注册号：NCT02755207）。所有患者均已签署知情同意书。

记录入院时所有患者的一般临床资料，包括年龄、性别、冠心病史、高血压病史、糖尿病史、吸烟史；并采用袖带法测量患者入院即刻血压，记录收缩压及舒张压。所有胸痛患者行超声心动图检查，记录左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。随访所有患者，统计其在确诊30 d内的心血管不良事件的发生情况，包括再发心肌梗死、心绞痛、心力衰竭及心源性死亡等。

1.2 实验室指标测定

采用电化学发光仪（Beckman Coulter，美国，Access2）检测所有患者入院即刻的cTnI、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）和肌红蛋白（myoglobin，Mb）水平。采用电化学发光仪（Roche，瑞士，Cobas E411）检测N末端B型脑钠肽前体（N-terminal B-type natriuretic，NT-proBNP）水平。采用全自动生化免疫分析仪（Johnson& Johnson，美国，VITROS 5600）测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TAG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-Ch）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-Ch）及肌酐（creatinine，Cre）的水平。

1.3 冠状动脉造影检查

对AMI组和UAP组患者行冠状动脉造影检查。该检查均由经验丰富的心血管介入医师完成，并按照常规投射体位行左右冠状动脉造影。Gensini评分是用于评估冠状动脉病变严重程度的评分系统[19]。规则如下：管腔狭窄1%～25%计1分，管腔狭窄26%～50%计2分，管腔狭窄51%～75%计4分，管腔狭窄76%～90%计8分，管腔狭窄91%～99%计16分，完全狭窄计32分。

1.4 样本收集及血清miR-133a检测

所有胸痛患者入院后立即采集血样至非抗凝管中，于4 ℃ 1 499×g离心10 min获得血清，并将其转至无RNA酶的1.5 mL离心管中，于-80 ℃保存备用。而后，为明确AMI患者经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）术后miR-133a水平变化，抽取14例AMI患者PCI术后24 h血清样本并于-80 ℃保存，用于后续检测。

应用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR）仪（ABI，美国，7500）自带分析软件检测血清中miR-133a水平。该qPCR为加尾法，以U6 为内参，用miRNeasy血清血浆纯化试剂盒（Qiagen，德国，应用生物系统）进行小RNA提取，用Mir-X™miRNA First Strand Synthesis Kit miRNA反转录试剂盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，再用Mir-XTMmiRNA qRT-PCR TB GreenTMKit试剂盒（TaKaRa，日本）进行qPCR，所有操作均严格按照说明书进行。设置3个复孔，记录每孔的CT值，以3个复孔的平均值作为最终结果。采用2-ΔΔCT法分析结果。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.5 统计学方法

应用GraphPad Prism 7和SPSS 23.0对研究数据进行统计分析。定性资料以频数和百分率表示，采用独立样本χ2检验及t检验。符合正态分布的定量资料以x—±s表示，不符合正态分布的定量资料以M（Q1，Q3）表示。采用单因素方差分析、Spearman相关性对3组间进行比较。采用多因素Logistic回归模型对AMI的危险因素进行分析。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）下面积（area under the curve，AUC）分析miR-133a对AMI的早期诊断价值及30 d内心血管不良事件发生率的评估价值。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料分析

本研究共纳入90例胸痛患者，根据AMI的诊断指南分为AMI组、UAP组和对照组。采用χ2检验及t检验对患者的临床资料（包括分类数据、连续性数据）进行比较分析，结果显示3组患者的年龄、性别、糖尿病史、吸烟史、高血压病史、入院即刻血压、LVEF及30 d内不良心血管事件发生率间差异均无统计学意义，而仅冠心病史的组间差异显著（P=0.003）；实验室指标的检测结果显示，3组患者的cTnI、Mb、CK-MB及TAG间差异具有统计学意义（均P＜0.05）；同时，AMI组和UAP组患者的Genisi评分间差异亦具有统计学意义（P=0.010）。具体数据详见表2。

表2 3组患者的临床资料比较Tab 2 Comparison of clinical data among the three groups

Continued Tab

2.2 3组患者血清miR-133a的表达水平及与心肌损伤指标的相关性分析

采用qPCR检测入组患者即刻血清中miR-133a的表达，结果（图1A）显示AMI组患者血清中miR-133a的相对表达水平（5.85±2.43）高于UAP组（4.68±1.44）和对照组（0.95±0.38），且差异均有统计学意义（P=0.046，P=0.000）。随后，针对14例AMI患者PCI术后24 h血清miR-133a的表达进行分析，结果显示与术前相比，术后miRNA-133a的表达水平较低（5.02±1.89vs2.70±1.16，P=0.001）。

图1 miR-133a表达水平及其与心肌损伤指标的相关性分析Fig 1 Expression level of miR-133a and its correlation with myocardial injury indexes

考虑到患者cTnI、Mb、CK-MB临床实测值间差异较大且不符合正态分布，而对该数据进行ln转化后则均服从正态分布，因此采用Spearman相关性分析对转化后的数据进行分析。结果（图1B～D）显示：miR-133a 的表达与 cTnI（r=0.155，P=0.000）、Mb（r=0.658，P=0.001）及CK-MB（r=0.090，P=0.004）均呈正相关。

2.3 miR-133a对AMI的早期诊断价值

应用ROC曲线分析比较miR-133a和临床常用心肌损伤标志物cTnI对AMI的早期诊断价值，结果显示miR-133a的 AUC 为 0.816（95%CI0.716～ 0.917），cTnI的AUC为0.796（95%CI0.691～0.901），具有统计学意义（P=0.000，图 2）。

2.4 miR-133a与Gensini评分的相关性分析

记录行冠脉造影检查患者的Gensini评分，并采用Spearman相关分析对miR-133a与冠状动脉狭窄程度间的相关性进行评估，结果（图3）显示患者血清miR-133a的表达水平与Gensini评分均呈正相关（r=0.263，P=0.001）。

图2 miR-133a对AMI诊断的ROC曲线Fig 2 ROC curve of miR-133a for AMI diagnosis

2.5 多因素Logisitic回归模型分析AMI的危险因素

图3 miR-133a的表达水平与Gensini评分的相关性分析Fig 3 Correlation analysis between expression level of miR-133a and Gensini score

以是否发生AMI为因变量，以患者临床资料分析中有统计学意义的因素为自变量，采用多因素 Logistic 回归模型对AMI的危险因素进行分析，结果显示miR-133a和冠心病史是AMI发生的独立危险因素（均P＜0.05，表 3）。

表3 AMI危险因素的多因素Logisitic回归分析Tab 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors in the incidence of AMI

2.6 miR-133a和cTnI对AMI患者30 d内不良事件发生率的评估价值

通过随访患者30 d，对其心血管不良事件的发生情况进行统计，结果显示AMI组发生心源性死亡2例、再次心肌梗死1例、心绞痛2例、心力衰竭1例，UAP组发生心绞痛3例，对照组发生心力衰竭1例。采用ROC曲线分析miR-133a与cTnI对AMI患者30 d内心血管不良事件的预测价值，结果（图4）显示miR-133a的AUC为 0.700（95%CI0.535～ 0.865），cTnI的 AUC 为 0.544（95%CI0.387～0.701）。随后对ROC曲线做进一步分析，结果（表4）显示miR-133a的灵敏度和特异度较高。

图4 miR-133a与cTnI对AMI患者30 d内心血管不良事件预测价值的ROC曲线Fig 4 ROC curve of the predictive value of miR-133a and cTnI for 30-day cardiovascular adverse events in patients with AMI

表4 miR-133a和cTnI对AMI患者30 d内心血管不良事件发生率的比较分析Tab 4 Comparative analysis of miR-133a and cTnI on the incidence of 30-day cardiovascular adverse events in AMI patients

3 讨论

临床上，AMI病情变化快、死亡率高，是常见的心血管急重症之一。因此，对该疾病的早期精准诊疗是预防患者死亡及其他心血管不良事件发生的重要手段。传统观念认为cTnI是AMI早期诊断的经典生物标志物，而近期研究则证实cTnI在诊断AMI的特异度和灵敏度均有所下降[5-6]。miRNA是一类内源性的短RNA片段，不编码蛋白质。相关研究[20-23]显示，其参与了多种疾病的发生与发展过程，如癌症、神经退行性疾病、心力衰竭等。此外，miRNA具有良好的组织特异性和稳定性[24]。近期的多项研究[25-26]证实，miRNA可作为AMI早期诊断的生物标志物。Gacoń等[16]研究发现，心肌梗死患者病变血管闭塞与未闭塞相比，其miR-133a的表达可升高7倍，但cTnI的表达无差异。因此，寻求特异度和灵敏度更高的AMI早期诊断的生物标志物是十分必要的。

本研究中，我们以紧急胸痛就诊的患者为研究对象，通过检测胸痛患者血清中miR-133a的表达水平，分析miR-133a与冠状动脉病变严重程度的关系，并进一步阐明miR-133a作为AMI早期诊断标志物的潜在应用价值。结果显示，AMI组患者血清中miR-133a的水平显著高于UAP组和对照组；Spearman相关性分析提示，miR-133a的表达水平与cTnI、CK-MB、Mb水平均呈正相关；ROC曲线分析显示，与cTnI相比，miR-133a对AMI具有较好的诊断价值；同时经多因素Logisitic回归模型分析提示，miR-133a是AMI发生的独立危险因素。上述结果均提示，miR-133a可能是AMI早期诊断的潜在新型生物标志物。

一个理想的生物标志物不仅应具有较高的敏感度和特异度，还应当能够对病变严重程度进行衡量[27]。本研究通过测量患者血清miR-133a水平，分析其与冠状动脉狭窄程度的相关性，结果发现上述两者呈正相关，从而进一步证明miR-133a来自心肌细胞；继而推测，miR-133a可能被证明是预测心肌缺血风险的标志物，或可作为预防和早期AMI干预的指标之一。本研究针对部分AMI患者PCI术后24 h血清miR-133a相对表达量检测发现，术后的表达水平较术前显著降低；继而说明，PCI与梗死相关动脉的通畅率、闭塞冠状动脉再灌注相关，及时行PCI可预防心肌坏死。该结果与Araszkiewicz等[28]报道相一致。

随后，本研究通过随访追踪患者30 d内心血管不良事件的发生率，并行ROC曲线分析显示，miR-133a的AUC为 0.700（95%CI0.535～ 0.865），cTnI的 AUC为0.544（95%CI0.387～0.701）；经进一步分析发现，当miR-133a的截断值为5.80时，其敏感度为80%、特异度为67.9%，均略优于cTnI。由此可见，miR-133a对AMI患者30 d内发生心血管不良事件具有较好的预测价值。然而，由于本研究纳入的病例样本量较少、进行随访的时间较短，可能导致miR-133a对AMI患者的预后评估价值存在一定的差异；因此，后续需要进一步加大样本量并延长随访时间，对该研究结果作进一步验证。

综上所述，miR-133a的诊断效能较好，可作为早期诊断AMI的潜在生物标志物，且miR-133a可能与冠状动脉病变的严重程度及预后有关，有望作为预测AMI患者30 d内心血管不良事件发生率的指标之一，值得进一步探索。