低氘水联合富血小板血浆对大鼠糖尿病溃疡创面愈合的影响

王湘琦，赵超然，熊爱兵

西南医科大学附属医院烧伤整形外科，泸州 646000

糖尿病足溃疡（diabetes foot ulcer，DFU）是常见的糖尿病慢性合并症之一，是导致糖尿病患者截肢致残的主要原因。溃疡的发生被认为是截肢的前兆，而下肢截肢经常会导致糖尿病患者死亡，70%的患者在截肢手术后5年内死亡[1-2]。DFU的高截肢率和高死亡率，严重影响患者的生活质量，给家庭带来了经济负担。因此，预防和治疗DFU十分重要。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）属于血小板浓缩物，含有大量高浓度的生长因子，可促进软组织的修复。前期有学者研究发现，PRP对于糖尿病溃疡创面愈合有独特的优势和效果[3]，在统计学上有更高的愈合率和更低的并发症发生率[4]。低氘水（deuterium depleted water，DDW）为氘体积分数低于0.015%的水[5]，有一系列生物学效应，如抗氧化、防衰老、抗抑郁、抗辐射、保护心血管系统、降血糖、抗肿瘤等作用[6]。本实验拟观察DDW联合PRP在大鼠糖尿病溃疡创面中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物

健康清洁级雄性 SD 大鼠120只，质量160～200 g，购自辽宁长生生物股份有限公司，生产许可证号为SCXK（辽）2015-0001，饲养于西南医科大学实验动物中心。

1.2 主要仪器与试剂

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、柠檬酸、柠檬酸三钠、葡萄糖均购自北京索莱宝公司；水合氯醛（源叶生物）；大鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织金属蛋白酶抑制物 -1（TIMP-1）Elisa试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；高速冷冻离心机（Eppendorf）；酶标仪（Rayto，RT-6100）；洗板机（Tianshi，988洗板机）；电热恒温箱（武汉-恒苏净科学仪器有限公司）；移液器（Finnpipette，20～200 μL）；罗氏血糖仪（活力型）、罗氏血糖试纸、飞科剃刀；高脂高糖饲料（67%大鼠维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+0.5%胆酸钠，由北京科澳协力饲料有限公司提供）；大鼠普通饲料（成都达硕生物科技有限公司）；低氘水（泸州哈罗德健康科技有限公司）。本实验用水符合三级水标准。

1.3 动物分组及模型的建立

健康清洁级雄性SD大鼠120只，适应性喂养1周后，选100只随机分为正常对照组（n=20）和糖尿病组（n=80），分别称取2组大鼠体质量，测随机血糖。剩余20只大鼠用于制取PRP，普通饲料饲养，不参与造模与分组。

1.3.1 糖尿病大鼠溃疡模型的建立及分组 糖尿病组大鼠予以高脂高糖饲料饲养。饲养4周后，禁食12 h（不禁水），给予1% 的STZ 溶液（临用前用0.1 mol/L、pH4.5的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液配制，冰浴、避光操作）单次腹腔注射（30 mg/kg），7 d后采用尾静脉采血法测大鼠随机血糖，血糖≥16.7 mmol/L表示糖尿病模型大鼠建立成功[7]。成模后以7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射进行麻醉，备皮消毒，在背部制作约3 cm×3 cm的正方形创面，深达筋膜。拍照后医用纱布覆盖创面，胶带包扎固定。将造模成功[8-9]的72只大鼠随机分为糖尿病模型组（B组）、PRP组（C组）、低氘水组（D组）及低氘水联合PRP组（E组），每组各18只。

1.3.2 正常大鼠溃疡模型建立 正常对照组（A组）继续予普通饲料喂养4周后，禁食12 h，不禁水，在相同操作条件下注射等体积的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液，7 d后采用尾静脉采血法测血糖。以7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射，备皮消毒，在背部制作约3 cm×3 cm的正方形创面，深达筋膜。拍照后医用纱布覆盖创面，胶带包扎固定。

1.4 PRP的制备

采用改良Landesberg法[10]制作。每次取2～3只大鼠，称重麻醉后，用预先装有1 mL柠檬酸葡萄糖溶液（ACD抗凝剂）的5 mL真空离心管及一次性静脉采血针，直视下从每只大鼠腹主动脉取血约10 mL（约5 mL血装一离心管），摇匀后，取1 mL全血进行全血细胞分析，测得血小板计数为646×109。第一次以200×g在4 ℃条件离心15 min，离心后管内全血分为3层，下层为红细胞，上层为上清液，中间交界层即富含血小板。在划分中层与下层两部分的线下方2 mm处标记，移取该点以上的全部内容物[11]至另一不装有抗凝剂的空白离心管，摇匀，再以500×g在4 ℃条件离心10 min，得到2个部分，上层即贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP），下层为含有少量红细胞、血浆和血小板混合物，即PRP。用移液枪吸取上份PPP，即获得PRP，经全血细胞分析测得血小板计数为 4 296×109。

1.5 各组干预方案

A组和B组：生理盐水灌胃，饮用普通水；溃疡局部常规消毒后涂抹生理盐水，然后无菌纱布覆盖。C组：生理盐水灌胃，饮用普通水；溃疡局部常规消毒后涂抹PRP，然后用无菌纱布覆盖。D组：低氘水灌胃，饮用低氘水；溃疡局部常规消毒后涂抹生理盐水，然后无菌纱布覆盖。E组：低氘水灌胃，饮用低氘水；溃疡局部常规消毒后涂抹PRP，然后用无菌纱布覆盖。各组灌胃量均为0.01 mL/ （g·d）[12]。每只大鼠均单笼饲养，于术后第1日开始换药，每日更换垫料1～2次，换药1次，并祛除创面硬痂。PRP每隔1 d使用1次，PRP及生理盐水每次每创面使用量均为100 μL。

1.6 样本获取及指标检测

分别于溃疡造模后的第3日、第7日及第14日，每组各随机选取6只大鼠，测血糖（早晨9时）后麻醉，照相并观察溃疡愈合情况。取创面及周围5 mm内组织，将一半肉芽组织进行苏木精-伊红染色（H-E染色），观察组织病理学改变；另一半立即置于液氮中冷却，随后-80 ℃保存，用于各组大鼠创面组织MMP-9、TIMP-1蛋白含量检测。

1.6.1 溃疡大鼠创面恢复情况 ①大体观察：观察创面的基本情况，拍照后用Image J图像软件进行溃疡面积的测量，以创面愈合率作为评价大鼠溃疡愈合情况的指标。创面愈合率= （创面初始面积-创面当前面积） /初始面积×100%。②组织病理形态学观察：取创面及周围5 mm内组织，进行H-E染色，使用光学显微镜观察创面的组织形态学变化，主要观察创面肉芽组织、新生毛细血管、成纤维细胞及胶原等的变化。

1.6.2 创面组织MMP-9和TIMP-1的检测 取创面及周围5 mm内组织，采用酶联免疫吸附法检测创面组织MMP-9和TIMP-1的含量。所有指标均按照试剂盒说明进行操作。

1.7 统计学方法

采用 SPSS 20. 0 软件进行统计学分析，定量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

正常对照组大鼠皮毛光亮，精神良好，皮脂丰厚。糖尿病组大鼠在STZ注射后精神状态变得稍差，皮毛粗糙、萎黄，且易脱毛，饮水量、饮食量、尿量明显增加；随着时间变化，体质量较正常对照组明显减轻，皮脂变薄。

2.2 正常对照组及糖尿病组大鼠体质量及血糖结果的比较

在适应性喂养1周后，2组大鼠体质量无明显差异；糖尿病组大鼠经高脂高糖饲料喂养4周后，体质量增长略比正常对照组大鼠快；正常对照组大鼠在经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射7 d后体质量稍有增长，而糖尿病组大鼠在经STZ注射7 d后体质量反而降低（表1）。

表1 造模前后大鼠体质量变化（x—±s，g）Tab 1 Changes in body weight of rats before and after modeling (x—±s, g)

初始状态下，糖尿病组大鼠的随机血糖与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；糖尿病组大鼠经高脂高糖饲料喂养4周后，其血糖较正常对照组稍高，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。在STZ/柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射7 d后，糖尿病组大鼠血糖较正常对照组明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明高脂饲料喂养配合STZ诱导的2型糖尿病大鼠模型建立成功（表 2）。

表2 造模前后大鼠血糖水平变化（x—±s，mmol/L）Tab 2 Changes of blood glucose level in rats before and after modeling (x—±s, mmol/L)

2.3 各糖尿病组大鼠血糖变化

A、B、C组在各干预时间点的随机血糖水平与干预前相比，差异无统计学意义；在D组及E组可观察到，在低氘水干预后大鼠随机血糖开始缓慢下降，在干预第14 日后较干预前明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 干预后不同时间点各组大鼠随机血糖变化（x—±s，n=6，mmol/L）Tab 3 Random blood glucose changes in rats of different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, mmol/L)

2.4 各组大鼠创面恢复情况及组织病理形态学观察

各组大鼠创面均无明显感染，有不同程度渗出、水肿及少量出血，随着时间推移各创面均在逐步愈合（图1）。在干预第3日，H-E染色结果显示：A组炎症细胞浸润明显，可见少量新生毛细血管及成纤维细胞；B组可见少量炎症细胞、成纤维细胞及新生毛细血管；C组可见炎症细胞浸润，有少量新生毛细血管及成纤维细胞；D组可见炎症细胞浸润，有少量新生毛细血管及成纤维细胞；E组可见炎症细胞浸润，伴少量新生毛细血管及成纤维细胞。在干预第7日，H-E染色结果显示：A组可见大量新生毛细血管及成纤维细胞，有少量胶原纤维，仍可见较多炎症细胞；B组可见炎症细胞浸润，新生毛细血管较其他组少，有少量成纤维细胞；C组见较多的新生毛细血管及成纤维细胞，有少量胶原纤维；D组可见较多的新生毛细血管及成纤维细胞，有少量胶原纤维；E组可见成纤维细胞及新生毛细血管增多，有少量胶原纤维，炎症细胞减少。在干预第14日，H-E染色结果显示：A组可见大量胶原纤维，少量新生毛细血管、成纤维细胞及炎症细胞；B组可见胶原纤维，少量成纤维细胞及新生毛细血管；C组可见较多胶原纤维及新生毛细血管，伴少量炎症细胞浸润；D组可见较多胶原纤维及新生毛细血管，伴少量炎症细胞浸润；E组可见大量胶原纤维及较多的新生小动脉和小静脉。各糖尿病组创面炎症反应均较正常对照组慢；E组肉芽成熟效果较其余3个糖尿病组快，在各干预组中效果最佳，新生血管及成纤维细胞出现时间早且数量多，为创面修复提供了前提条件（图2）。

图1 各组大鼠创面愈合情况的比较Fig 1 Comparison of wound healing in each group of rats

图2 各组大鼠创面组织H-E染色（×200）Fig 2 H-E staining of wound tissue in each group of rats (×200)

2.5 各组大鼠愈合率的比较

干预第3日：各糖尿病组大鼠创面愈合率均明显低于正常对照组（A组）（P＜0.05）；C组、D组及E组创面愈合率均高于B组（P＜0.05），但两两之间的差异均无统计学意义；各组创面愈合率由高到低依次为A组＞E组＞C组＞D组＞B组。干预第7日：A组创面愈合率大于B组、C组及D组（P＜0.05）；E组愈合率虽低于A组，但2组差异无统计学意义；各组创面愈合率由高到低依次为A组＞E组＞D组＞C组＞B组。干预第14日：A组创面愈合率大于B组、C组及D组（P＜0.05）；E组愈合率虽低于A组，但2组差异无统计学意义；各组创面愈合率由高到低依次为A组＞E组＞C组＞D组＞B组（表4）。

表4 干预后不同时间点各组大鼠创面愈合率的变化（x—±s，n=6，%）Tab 4 Changes of wound healing rate in rats of different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, %)

2.6 各组大鼠创面组织MMP-9含量的比较

各糖尿病组大鼠创面组织中MMP-9含量在观察的各时间点均明显高于正常对照组（A组）。C组、D组及E组在干预3 d后，MMP-9含量较B组明显降低（P＜0.05）；干预3 d后E组MMP-9含量较C组及D组明显降低，7 d后差异有统计学意义（P＜0.05）（表5）。

表5 干预后不同时间点各组大鼠创面组织MMP-9含量的变化（x—±s，n=6，ng/g）Tab 5 Changes of MMP-9 content in wound tissues of rats in different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, ng/g)

2.7 各组大鼠创面组织TIMP-1含量的比较

各糖尿病组大鼠创面组织中TIMP-1含量在各时间点均低于正常对照组（A组），而C组、D组及E组干预后TIMP-1含量均较B组升高（均P＜0.05）。E组干预3 d后TIMP-1含量升高较C组及D组明显（P＜0.05）；在干预14 d后，与A组差异无统计学意义（表6）。

表6 干预后不同时间点各组大鼠创面组织TIMP-1含量的变化（x—±s，n=6，ng/g）Tab 6 Changes of TIMP-1 content in wound tissue of rats in different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, ng/g)

3 讨论

皮肤是人体最大的器官之一，主要有3个关键作用：屏障功能、感觉功能、代谢功能。皮肤受损时，会经历伤口愈合的过程。伤口愈合的4个阶段是炎症、血管生成、再上皮化和重塑。由于各种原因，一些伤口修复减慢或中断，这些伤口被称为慢性伤口[13]。糖尿病慢性足溃疡是糖尿病患者较严重且常见的并发症，是常见的慢性伤口之一，在糖尿病人群中的终身发病率高达15%[14]。尽管发病率很高，但目前的治疗方案仍然有限。常见的外科治疗方法主要是清创，随后换药、控制感染和血糖水平。尽管采用了各种综合方法，但患者并发症发生率和截肢率仍然很高[15]。

2型糖尿病大鼠模型已较成熟。有研究[16-17]表明，STZ对胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用，通过自由基损伤胰岛β细胞，使其胰岛素的合成减少，进而引发糖尿病。通过高脂高糖喂养1～2个月诱导大鼠胰岛素抵抗后，再加小剂量一次性腹腔注射STZ来损伤胰岛功能，能引起血糖升高，模拟2型糖尿病发病的过程。张玉领等[18]发现高脂高糖喂养4周后，大鼠出现明显的肥胖及胰岛素抵抗，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制备2型糖尿病大鼠模型，其成模率高，模型稳定，无动物死亡，更适用于2型糖尿病的相关研究。

PRP是全血经离心后获得的高浓度血浆，富含多种生长因子，可促进软组织的修复。研究[4,19-20]表明，PRP治疗DFU有较好的疗效。本次实验也发现，经PRP干预后的糖尿病大鼠创面愈合率较模型组高。低氘水能够降低胰岛素抵抗性、降低糖尿病患者血糖含量[12,21-22]。Wang等[23]报道，低氘水可促进醌氧化还原酶1（NADPH: quinone oxidoreductase-1，NQO1）的表达，从而抑制MMP-9的表达。本研究也发现，低氘水干预组大鼠随机血糖在干预14 d后明显下降，在各个时间点的创面愈合率较糖尿病模型组高；说明低氘水可降低糖尿病大鼠随机血糖，对糖尿病大鼠溃疡创面愈合有促进作用。

研究[24]表明，糖尿病患者足部伤口中，MMPs表达增加，其抑制因子TIMPs表达减少，导致伤口难以愈合。MMPs是一组具有共同生物化学性质的可降解细胞外基质（extracellular matrix， ECM） 的锌依赖性肽链内切酶， 是参与 ECM 降解的主要蛋白酶之一；TIMPs 是 MMPs的特异性抑制因子，能调节 MMPs的活性。MMP-9是金属蛋白酶家族中相对分子质量最大的酶，可作用较广泛的底物，包括 Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ 型胶原，明胶，纤连蛋白，玻连蛋白及层粘连蛋白等，对这些底物起着降解作用[25]。MMP-9通过分解ECM成分参与伤口的愈合过程。糖尿病患者动脉中高含量的MMP-9能使中性粒细胞和巨噬细胞表达增强，这2种细胞是主要的炎症反应细胞，因此导致DFU延迟愈合[26]。TIMPs是 MMPs 的内源性抑制剂，可抑制MMPs 活性，刺激细胞分裂，结合ECM，抑制血管形成，诱导细胞凋亡[25]。TIMP-1 对 MMP-9 有直接的抑制作用，是 MMP-9的特异性抑制剂。TIMP-1与活性 MMP-9 形成非共价复合物，通过抑制MMP-9活性来减少ECM的降解。郑洁等[25]的研究表明，MMP-9与糖尿病溃疡的愈合密切相关，且MMP-9/TIMP-1有望成为未来DFU治疗的新靶点。本实验研究发现，糖尿病组大鼠创面MMP-9水平高于空白对照组，而经PRP、低氘水、PRP联合低氘水治疗后MMP-9明显降低，且低氘水联合PRP治疗组干预14 d后效果最明显；糖尿病组大鼠创面TIMP-1水平低于空白对照组，而经PRP、低氘水、PRP联合低氘水治疗后TIMP-1明显升高，且低氘水联合PRP治疗组干预14 d后效果最明显。

综上所述，低氘水联合PRP对大鼠糖尿病溃疡创面愈合有显著的促进作用，其可能与调控MMPs的表达有关，即通过提高溃疡创面TIMP-1表达，从而抑制MMP-9的表达，减少ECM的降解。