过表达miRNA-320对顺铂诱导卵巢早衰大鼠卵巢功能的影响*

赵 丽 刁瑞英 蔡昭炜 李青洋 陈 博 李雪玲 王志鸣

(1. 东莞市松山湖中心医院生殖中心，东莞 523326)(2. 深圳市第二人民医院生殖医学科，深圳 518000)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性40岁前发生的卵巢功能衰竭，临床表现为绝经且伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升的疾病[1]。miRNA是一类长度约为19～25个核苷酸的内源性非编码RNA，研究发现其在卵巢的生长发育衰老等过程中起到了重要的作用[2]。有研究发现，miRNA-320在多囊卵巢综合征患者卵泡上清液中的表达显著下降[3]，然而，目前关于miRNA-320对POF的影响鲜见报道。顺铂是临床癌症治疗应用最广泛的铂类药物，但其不良反应与卵巢的损害密切相关，其可诱导大鼠卵泡损伤、引起卵巢组织坏死并促进卵巢早衰[4]。因此，本实验采用顺铂诱导建立大鼠卵巢早衰模型，并转染miRNA-320模拟物，探讨miRNA-320对顺铂诱导卵巢早衰大鼠卵巢功能的影响，为临床治疗卵巢早衰提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物建模及分组

选择清洁级SD雌性大鼠32只，体质量200～220 g，购自中国科学院昆明动物研究所，实验动物生产许可证号：SCXK(滇)K2016-0001。将大鼠随机分为4组，每组8只。正常对照组：常规饲养，腹腔注射生理盐水，连续7 d；模型组[5]：6 mg/kg腹腔注射顺铂注射液，连续7 d；阴性对照组：在建立模型后转染NC agomir；miRNA-320 过表达组：在建立模型后转染miRNA-320 agomir；造模结束7 d后麻醉处死大鼠，取大鼠卵巢组织。

1.2 实验主要试剂

BCA蛋白定量试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司)；Trizol、miRNA-320、U6，购自美国Invitrogen公司；PGRMC1、BMP15、GAPDHqRT-PCR上下游引物，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；逆转录试剂盒，购自德国DBI公司；PGRMC1兔多克隆抗体、BMP15兔多克隆抗体、山羊抗兔二抗，购自美国LI-COR公司；雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)ELISA试剂盒，购自上海索莱宝生物科技有限公司。

2 观察指标

2.1 大鼠行为学变化

在实验过程中，每天观察各组大鼠饮食、活动和体毛等外在表现。

2.2 采用ELISA检测各组大鼠血清中E2、FSH、LH的含量

各组大鼠造模结束7 d后，腹主动脉取血，3 500 r/min离心10 min取血清，采用ELISA检测各组大鼠血清中E2、FSH、LH的含量。

2.3 采用HE染色，光镜下观察各组大鼠卵巢组织形态学变化

造模结束后，麻醉处死各组大鼠，取出卵巢置于4%多聚甲醛液中固定。制作石蜡常规切片，HE染色，光镜下观察大鼠卵巢组织形态变化。

2.4 采用qRT-PCR检测各组大鼠卵巢组织miRNA-320的表达水平

取卵巢组织加入1 mL Trizol提取总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。引物序列Ⅰ见表1。

表1 引物序列ⅠTable 1 The sequence of primers Ⅰ

反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。各组基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算，每个样本重复检测3次。

2.5 采用Western blot和qRT-PCR法检测各组大鼠卵巢组织中PGRMC1、BMP15的表达水平

提取总蛋白后采用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离蛋白质，电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，添加PGRMC1及BMP15兔多克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；添加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000稀释)，室温下孵育1 h。洗膜后，用凝胶成像分析系统检测条带，Image J软件测定条带灰度值，以β-actin为内参计算PGRMC1及BMP15的蛋白相对表达量。qRT-PCR法参照方法2.4。引物序列Ⅱ见表2。

表2 引物序列ⅡTable 2 The sequence of primers Ⅱ

3 统计学方法

4 结果

4.1 各组大鼠行为学变化

正常对照组大鼠活动、进食排便均正常，体毛光滑有光泽；模型组及阴性对照组大鼠活动迟缓、无精神、反应迟钝、食欲下降、体质量下降以及体毛暗淡无光泽；miRNA-320过表达组大鼠活动量增加、反应较为敏捷、进食增多且体毛逐渐有光泽。过表达miRNA-320可改善模型组大鼠的行为学能力。

4.2 各组大鼠血清中E2、FSH、LH的含量

与正常对照组相比，模型组及阴性对照组大鼠血清E2的含量降低而FSH、LH的含量升高；与阴性对照组相比，miRNA-320过表达组血清E2的含量升高而FSH、LH的含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中E2、FSH、LH的含量Table 3 The serum levels of E2，FSH and LH in different groups

4.3 各组大鼠卵巢组织形态学变化

正常对照组卵巢组织内可见丰富的卵泡及黄体，间质纤维组织少，颗粒细胞层次多；模型组及阴性对照组观察卵巢组织明显萎缩，闭锁卵泡数目多，间质纤维组织增多，黄体数少；miRNA-320 过表达组间质纤维化明显减轻，成熟卵泡数量明显增加，黄体数增多。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织形态学变化(HE染色)Fig.1 The histological changes of ovaries in different groups(HE staining)

4.4 各组大鼠miRNA-320的表达水平

与正常对照组相比，模型组及阴性对照组大鼠miRNA-320的表达水平降低，而miRNA-320过表达组miRNA-320的表达水平与阴性对照组相比升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠miRNA-320相对表达量注：与正常对照组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，#P<0.05Fig.2 The relative expression of miRNA-320 in different groupsNote:Compared with the normal control group,*P<0.05；Compared with the negative group,#P<0.05

4.5 各组大鼠卵巢组织中PGRMC1、BMP15蛋白及mRNA表达水平

与正常对照组相比，模型组及阴性对照组大鼠PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA表达水平均降低，而miRNA-320过表达组PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA的表达水平与阴性对照组相比均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠卵巢组织中PGRMC1、BMP15蛋白及mRNA表达水平注：与正常对照组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，#P<0.05Fig.3 The expression levels of PGRMC1，BMP15 and mRNA in ovaries of different groupsNote:Compared with the normal control group,*P<0.05；Compared with the negative control group,#P<0.05

5 讨论

POF可由多种因素引起，如感染、代谢疾病、自身免疫性疾病、放射、化疗或卵巢的物理损伤。化疗或放疗治疗癌症患者的副作用之一是增加卵巢损伤，从而导致不孕[6]。顺铂是一种常用的化疗药物，有研究表明其在杀死肿瘤细胞的同时也可对正常细胞造成不同程度的伤害，而顺铂在化疗过程中引发卵巢功能低下的报道逐年增加[7-9]。研究表明，可通过测定激素如FSH、E2、抑制素B等水平来评估化疗引起的卵巢损伤[10]。因此，本研究建立了顺铂处理大鼠卵巢损伤的POF模型。7 d后，模型组大鼠活动迟缓、无精神、反应迟钝、食欲下降、体质量下降以及体毛暗淡无光泽，而正常对照组大鼠活动、进食排便均正常且体毛光滑有光泽。组织形态学分析表明，卵巢组织明显萎缩，皮质变薄，闭锁卵泡数目多，间质纤维组织增多。此外，与正常对照组相比，血清FSH、LH显著升高，而血清E2显著降低，上述结果提示卵巢功能明显受损，并成功通过顺铂建立POF模型。

骨形态发生蛋白15(BMP15)具有卵母细胞特异性表达模式，在早期卵泡形成中起着重要作用[11]。有研究表明，BMP15可介导原始卵泡的激活、影响E2和孕酮的分泌，BMP15缺失会导致卵巢衰竭[12]。孕酮受体膜成分1(PGRMC1)属于膜相关孕酮受体家族，其可促进乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌等发生发展[13-15]。PGRMC1基因在啮齿动物和灵长类卵巢的颗粒细胞和黄体细胞中高度表达，其在抗凋亡和调节细胞周期进程中的作用提示其可调节卵泡生长。本研究结果发现，与正常对照组相比，模型组大鼠卵巢组织中PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA表达水平均降低，提示顺铂通过抑制PGRMC1、BMP15的表达，导致卵巢功能紊乱，促进卵巢早衰。

miRNA作为重要的基因表达调控分子，通过与靶基因mRNA碱基互补配对，调控靶基因表达，在细胞增殖分化、凋亡、代谢等一系列生理过程中发挥作用[16]。有研究发现，miRNA-320在上皮性卵巢癌组织中呈低表达，上调SKOV3细胞中miRNA-320表达可抑制细胞增殖及细胞侵袭力[17]。Zhang等[18]研究发现，miRNA-320可通过靶向抑制Runx2，调节Runx2/CYP11A1级联反应，促进多囊卵巢综合症患者的雌激素合成。本研究结果发现，与阴性对照组相比，miRNA-320 过表达组大鼠活动量增加、反应较为敏捷、进食增多且体毛逐渐有光泽。过表达miRNA-320可改善模型组大鼠的行为学能力。此外，miRNA-320 过表达组大鼠血清E2的含量升高而FSH、LH的含量降低。组织形态学分析表明，miRNA-320 过表达组间质纤维化明显减轻，成熟卵泡数量明显增加，黄体数增多。过表达miRNA-320后，卵巢组织中PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA的表达水平与阴性对照组相比均显著升高；提示过表达miRNA-320可改善顺铂诱导的卵巢早衰，具有调节卵巢功能的作用。

综上所述，顺铂可诱导卵巢早衰大鼠卵巢功能障碍；过表达miRNA-320可改善顺铂诱导的卵巢早衰大鼠的卵巢功能，为临床治疗POF提供理论依据。