益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠VEGF基因表达及线粒体凋亡通路的影响

雷裕君，吴 鹏，黄立武，唐 农，林 飞

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是指由各种脑血管因素所致的以记忆和认知功能障碍为主要特征的综合征，目前是导致老年人致残的三大疾病之一［1］。随着人口老龄化，脑血管疾病发生率逐年上升，VD的发病率也在逐渐增长，给社会和家庭带来沉重的经济负担［2］。由于血管性痴呆发病原因及病理机制十分复杂，目前其发病机制尚不清楚。我们在前期的研究中发现［3］，缺血后脑细胞的损伤与自由基代谢的紊乱密切相关，是缺血性脑损伤的关键环节。VEGF表达在缺血性脑损伤的血管反应中可促进新生血管，改善脑损伤。同时线粒体作为细胞能量代谢重要的器管，是生成能量的主要场所，发生缺血改变时线粒体氧化分解功能障碍，可使学习记忆的关键区域（海马、皮层）区域受损，出现记忆力和认知功能下降。益肺宣肺降浊方是广西名中医唐农教授临床治疗痴呆的经验方，本研究通过观察益肺宣肺降浊方对血管性痴呆模型大鼠脑内血管内皮生长因子（VEGF）基因表达及大脑皮层线粒体功能的影响，探讨该方治疗血管性痴呆的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康雄性大鼠，SPF级，100只，体质量200±20 g，购于广西医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（桂）2005－0003。大鼠行为测试无异常，给予自由饮水与摄食，日光辅助照明，至少每日维持在12 h以上。湿度适中，按时通风，更换垫料。

1.2 药物 益肺宣肺降浊方（由桔梗、杏仁、人参、麦冬、黄芪、三七、苏子、石菖蒲、酒大黄组成），以上药材由我院药剂科统一采购，并在医院制剂室制备成浓缩液，浓度为0.15 g/ml。安理申口服制剂[卫材（中国）药业有限公司生产，国药准字H20070181，批号：130635A]。

1.3 主要试剂及仪器 兔抗大鼠VEGF多克隆抗体、即用SABC免疫组化染色试剂盒和VEGFmRNA原位杂交试剂盒，均为武汉博士德生物工程有限公司产品；三磷酸腺苷（ATP）和线粒体呼吸链复合物测定试剂盒，为上海酶联生物技术有限公司产品，批号：20170220；Morris水迷宫由广西中医药大学第一附属医院提供。

2 方法

2.1 动物模型的制备 大鼠适应性喂养1周后，参照经典的2-VO法（双侧颈动脉结扎方法）［4］建立模型。采用10%水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉实验大鼠，仰卧位固定，将颈前部的毛发剃除干净、消毒、切开皮肤，钝性分离双侧颈总动脉，分别结扎近心端与远心端，剪断其中间阻断血流，缝合皮肤、消毒。假手术组只进行上述相应的手术步骤，不进行结扎，只分离暴露双侧颈总动脉阻断其血流供应。

2.2 分组 造模成功后将实验大鼠随机分为4组：模型对照组、假手术组、益肺宣肺降浊方组、安理申组，每组25只。益肺宣肺降浊方组:剂量为1.5 g/（kg·d），每天灌胃1次，灌胃容量为10ml/kg；安理申组：剂量为0.4mg/（kg·d），分2次灌胃，灌胃容量为10m l/kg；模型对照组及假手术组:给予等容量的生理盐水灌胃，1次/天。各组均连续灌胃28 d。

2.3 标本采集及指标检测 末次灌胃24 h后，麻醉并处死大鼠，断头取脑组织，去除嗅球和小脑，取大鼠缺血侧大脑作VEGF测定，主要取大鼠大脑的海马区的组织，常规切片脱蜡、染色、封片，在光镜下观察30个视野，运用阳性细胞计数法，取每个视野的阳性细胞均值作为计数。按线粒体提取试剂盒说明书提取各组海马和大脑皮层部位的线粒体，按试剂盒说明书采用比色法检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的活性和ATP的含量。

2.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，所有的统计检验均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠海马区域VEGF阳性细胞数比较 见表1。与模型对照组比较，安理申组和益肺宣肺降浊方组VEGF阳性细胞数明显增多（P＜0.05）。

表1 各组大鼠海马区域VEGF阳性细胞数（）

表1 各组大鼠海马区域VEGF阳性细胞数（）

注：与模型对照组比较，①P＜0.05

组别假手术组模型对照组安理申组益肺宣肺降浊方组n 25 25 25 25 VEGF阳性细胞数7.820.63 25.340.86 45.674.59①42.384.26①

3.2 各组大鼠海马组织ATP含量及线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ活性比较 见表2。与假手术组比较，模型对照组大鼠海马组织ATP含量及线粒体呼吸链各复合物的活性均明显降低（P＜0.05）；与模型对照组比较，安理申组及益肺宣肺降浊方组大鼠海马组织线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ的活性及ATP含量明显升高，有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠海马组织ATP含量及线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ活性比较（）

表2 各组大鼠海马组织ATP含量及线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ活性比较（）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型对照组比较，②P＜0.05

组 别假手术组模型对照组安理申组益肺宣肺降浊方组n 25 25 25 25线粒体复合物Ⅰ（U/g）56.98±14.86 35.25±7.96①49.65±3.84②45.92±10.36②线粒体复合物Ⅱ（U/g）12.96±2.39 4.59±2.03①8.59±0.88②13.63±3.65②线粒体复合物Ⅲ（U/g）10.21±2.01 5.57±1.89①10.94±3.24②9.25±3.82②线粒体复合物Ⅳ（U/g）11.68±2.50 5.96±1.59①13.05±0.96②13.11±4.26②线粒体复合物Ⅴ（U/g）389.26±25.75 96.38±16.35①625.63±148.36②1213.63±126.50②ATP（μmol/g）1.35±0.56 0.53±0.13①1.53±0.39②1.20±0.33②

4 讨论

VD属于中医学“痴呆”范畴，唐农教授从“肺主宣降”“肺朝百脉”的中医理论观点出发，认为肺气虚损在VD的发生发展中起着非常重要的作用。肺主气、司呼吸，肺的功能受损，宣发肃降失常，则清气不升，浊气不降，痰浊内停，阻闭经络，导致脏腑的功能失调。肺失宣降，脑髓失养，痰浊内停，易使神机受损而致痴呆。《灵枢·天年》有言：“肺气衰，魄离，故言善误”，而“言善误”正是痴呆病的重要症状，故认为痴呆乃肺气虚，脑海失养所致。

基于以上认识，近年来课题组以宣肺降浊法防治VD已取得了一定的研究成果［5］。益肺宣肺降浊方组成如下：桔梗10 g，杏仁10 g，人参15 g，麦冬15 g，黄芪15 g，三七15 g，苏子15 g，石菖蒲15 g，酒大黄6 g。其中人参、黄芪为君，补益肺脏之气阴，治其本虚；麦冬、桔梗、杏仁、苏子为臣，宣降肺气，调节气机；酒大黄通腑导滞、解毒降浊，石菖蒲、三七调畅全身气机，活血通滞，为佐使。全方辛开苦降，攻补兼施，气血同治、脏腑同调，组方严谨，与“从肺论治痴呆”的理论丝丝相扣。

血管性痴呆主要是由于各种脑血管疾病引起，尤其对海马部位的损害大，从而导致学习、行为能力下降。VEGF是一种刺激血管内皮生长、促进血管生长的蛋白，是大脑缺血后重要调控因子之一，当血管中缺血缺氧发生后VEGF的表达会增多。线粒体是脑组织中细胞能量生成的主要场所，有研究指出［6］，缺血大鼠海马组织中线粒体丙酮酸脱氢酶蛋白水平降低，氧化应激水平增加。由于线粒体的氧化代谢障碍，导致线粒体动力学发生异常，直接影响神经元凋亡和损害，从而致使VD发病。本研究结果表明，益肺宣肺降浊方能上调VEGF表达，显著升高线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ的活性及ATP含量，发挥抗VD的作用从而保护脑部神经细胞，改善脑代谢，减轻氧化损伤，这可能是该方治疗血管性痴呆的作用机制之一。