PGPR复合菌剂对辣椒生长及根际土壤微生物结构的影响

黄文茂，易 伦，彭思云，黄承森，程代松，韩丽珍*

（1．贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵州 贵阳 550025；2．贵州遵义市播州区蔬菜产业发展中心，贵州 遵义 563100；3．贵州遵义山那边生态农业有限公司，贵州 遵义 563112）

辣椒（Chilli）是一种喜中偏酸性砂壤植物［1］，是世界上最重要的蔬菜作物之一，因其富含维生素C和辛辣调味功能，所以在食材来源上备受关注［2-3］。近年来市场对辣椒需求量的激增，大量施用化学肥料成为了最直接的增产措施，但这也导致了种植成本投入增加、环境污染、土壤板结等一系列问题，同时还降低了果实的品质［4］。随着农业可持续发展的社会意识不断增强，传统的农业栽培措施（如化肥、化学杀虫剂等）恶化生态环境所带来的负面影响开始引起人们的重视［5］。因此，寻求一种能够有效减少化肥用量、环境友好且符合农业可持续发展要求的新型肥料已成为农业生产及环境科学领域的一个热点。

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，简称PGPR）是指可直接或间接地促进植株生长的微生物类群，广泛分布于植物根围土壤中［6］。PGPR的促生机制有多种，如改变土壤中矿物元素形态、分泌植物生长激素、修复污染土壤、生防效应等，近年来已被开发成不同制剂施加到各类作物上，并取得了预期的效果。PGPR制成的各种菌肥在替代化肥、农药及其他补充剂等化学制剂上所表现出来的可行性，表明其在农业生产中具有巨大的开发潜力［7］。

目前国内外较多地报道了PGPR菌肥在实验室或温室条件下对辣椒的促生效果［8-9］。但在田间复杂环境下，鲜有关于PGPR菌肥对辣椒的促生作用及其对植株根际土壤微生物结构、数量变化影响的研究。因此，本文以实验室前期从茶树根际分离筛选到、且具有优良促生能力的4株PGPR菌株制成液体复合菌剂，在田间条件下对辣椒进行促生研究，探究PGPR复合菌剂对辣椒的促生效果，并对根际土壤微生物的结构与数量进行了动态监测，旨在为辣椒PGPR复合菌剂的进一步研发和推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及试验材料

供试PGPR菌株是由贵州大学微生物学实验室分离筛选得到的4株茶树根际促生菌菌株：HGD3（Pseudomonas putida）、HGD12（Bacillus flexus）、HP9（Bacillus velezensis）、HP10（Bacillus firmus）。试验所用辣椒品种为艳椒425。

1.2 试验大田概况

试验地点位于贵州省遵义市播州区枫香镇枫元村堰塘组（E106°34′23″，N27°35′29″），所处纬度较低，常年气候温凉湿润，雨量充沛且光照充足。试验大田土壤类型为水稻土，土壤理化指标如下：有机质含量36.57 g/kg，全氮2.16 g/kg，全磷1.28 g/kg，全钾13.53 g/kg，碱解氮164 mg/kg，有效磷74 mg/kg，速效钾150 mg/kg。前茬作物为豇豆和蚕豆。

1.3 PGPR复合菌剂的制备

将甘油保存的PGPR菌种HGD3、HGD12、HP9、HP10按1%比例分别接种于LB（Luria-bertani）液体培养基中，180 r/min、30℃摇床培养12 h进行活化，活化菌液分别按5%比例转接至LB液体培养基中扩培24 h，培养液于7 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用适量新鲜培养基将菌体重悬至细胞浓度为1010cfu/mL，等量混合4株PGPR菌液备用。使用时进行25倍稀释。

1.4 试验设计

共设计了3个试验处理：100%化肥组为对照（CK）、100%化肥+PGPR复合菌剂（CF1-PGPR）、80%化肥+PGPR复合菌肥（CF2-PGPR）。其中，100%化肥施用标准为：化肥（总养分≥45.0%，N-P2O5-K2O：15-15-15）750 kg/hm2， 磷酸二铵（总养分≥64.0%，N-P2O5-K2O比例为18-46-0）300 kg/hm2。PGPR复合菌剂的处理分为3次，分别于移栽后7、30及60 d进行灌根，每株100 mL自来水稀释的菌液（实际含PGPR菌液4 mL）。

3个试验处理中，每处理为一个试验大区，大区长24 m，宽2.8 m，面积为67.2 m2；每个大区等分为3个重复小区，小区长8 m，宽2.8 m，面积为22.4 m2，相邻大区间隔70 cm，每大区分为两垄，垄间距60 cm，垄宽50 cm，每垄种植两行，采用错位种植法进行种植，株间距50 cm。起垄时进行化肥施加，在起垄工作结束后用隔离带分别将各大区、各重复小区进行隔离标识。育苗、移栽、种植均按常规措施进行。

1.5 测定方法

1.5.1 辣椒农艺性状及生育指标的测定

在始花期（移栽后30 d）、坐果期（移栽后60 d）、盛果期（移栽后90 d）分别从各重复小区里随机选取10株辣椒测定株高和茎粗；测定了单株辣椒的挂果数、产量，并对总产量进行了最终统计。

1.5.2 根际土壤采集及土壤可培养微生物数量的测定

辣椒根际土壤的采集参照Courchesne等方法［10］，前两次土样的采集时间为菌剂第一次灌根20 d后，第二次灌根30 d后进行，分别对应于始花期（移栽后30 d）和坐果期（移栽后60 d）；第三次土样的采集时间为移栽后90 d，对应于盛果期。以稀释平板计数法对根际土壤微生物数量进行测定。细菌数量的测定采用LB固体培养基［11］、放线菌为改良高氏一号固体培养基［12］、真菌为氯霉素-孟加拉红固体培养基［13］；溶磷菌数量测定采用NBRIP固体培养基［14］、固氮菌为阿须贝氏固体培养基［15］、解钾菌为解钾硅酸盐细菌固体培养基［16］。

1.6 数据分析及作图

试验结果采用SPSS 20.0进行one way-ANOVA统计处理，用Office 2019进行数据统计，输出结果为各大区重复小区中所测得平均值。

2 结果与分析

2.1 PGPR复合菌剂对辣椒生长的影响

测定了辣椒始花期、坐果期和盛果期的株高（表1），结果表明，在始花期，100%化肥+PGPR菌剂和80%化肥+PGPR菌剂的两个处理均显著促进了辣椒植株的增高，与100%化肥组（CK）相比，分别增加了11.19%和7.34%；在坐果期，处理组的株高分别增加了7.06%、11.08%；在盛果期，处理组的株高分别增加了8.51%和12.63%，且80%化肥+PGPR菌剂处理较CK呈现显著性差异（P＜0.05）。

对辣椒的茎粗测定结果显示，100%和80%化肥配施PGPR复合菌剂处理的辣椒茎粗均明显增加（表1），且达到显著性差异水平（P＜0.05）。相对于CK，经100%化肥+PGPR菌剂和80%化肥+PGPR菌剂处理后，辣椒茎粗在始花期分别增加了11.19%和11.13%，坐果期和盛果期茎粗增长明显，分别较对照（CK）增加了20.7%、22.01%和21.14%、22.14%。但从坐果期到盛果期的测定结果表明，这个时期主要是辣椒的生殖生长阶段，株高和茎粗基本未发生变化。

表1 PGPR复合菌剂对辣椒植株生长的影响 （cm）

2.2 PGPR菌剂对辣椒果实质量、坐果及产量的影响

比较了不同处理组的单株挂果数（表2），结果显示添加复合菌剂的两种处理均可以显著促进辣椒挂果（P＜0.05）。相比于100%化肥组（CK），添加了PGPR菌剂处理的辣椒挂果数增长了32.17%，而80%化肥+PGPR菌剂处理对辣椒挂果具有更强的促进作用，较CK增加了52.55%。果实指数分析结果表明，各处理间的辣椒果实果长、果径及果形指数没有显著性差异（P＜0.05），表明PGPR在促进辣椒挂果的同时，并不会对果实的品质产生不利影响。

单株产量的测定结果显示，PGPR复合菌剂的灌根处理有显著的促生效果（P＜0.05）。与对照CK相比，经100%化肥+PGPR菌剂及80%化肥+PGPR菌剂处理后，辣椒的单株产量分别增加了34.14%和38.76%。施加100%化肥组（CK）收获的鲜椒为26 804.26 kg/hm2，而添加PGPR菌剂的100%化肥组的鲜椒产量为35 956.16 kg/hm2，添加复合菌剂的80%化肥组的鲜椒产量达37 193.28 kg/hm2，分别较CK增产约9 150和10 390 kg/hm2。

表2 PGPR复合菌剂对辣椒果实质量、坐果及产量的影响

2.3 PGPR复合菌剂对根际土壤微生物的影响

2.3.1 根际土壤中微生物数量的动态变化

对辣椒3个时期根际土壤中微生物数量变化进行了动态监测（图1），结果表明PGPR复合菌剂对辣椒根际微生物总量（细菌、真菌、放线菌数量之和）影响显著（P＜0.05）。在始花期，CF1-PGPR和CF2-PGPR两种处理根际土壤中的微生物总量比CK分别增加了71.48%和47.03%，坐果期总量分别增长了4倍和1倍，在盛果期微生物总量出现下降趋势，但复合菌剂处理组仍与CK呈显著差异。

图1 不同处理组辣椒根际土壤微生物总量的动态变化

2.3.2 根际土壤三大菌群数量变化

不同施肥处理对土壤中微生物的结构和数量影响显著。经100%化肥+PGPR、80%化肥+PGPR的处理组中，无论是始花期、坐果期和盛果期，细菌数量均显著增加（P＜0.05），其中后两个处理生长时期的细菌总数较对照增加了1倍以上，尤以100%化肥+PGPR处理更为显著；而根际土壤中的真菌数量均低于100%化肥（CK）处理组，坐果期和盛果期的根际土壤真菌数比CK分别降低了12.14%、37.28%和83.90%、82.02%；复合菌剂对前两个生长时期的放线菌数量并没有显著影响，但导致了盛果期的放线菌数量显著提高，尤以100%化肥+PGPR复合菌剂的处理更为显著。

2.3.3 根际土壤功能微生物的变化

表3显示了始花期、坐果期和盛果期各处理间辣椒根际土壤中溶磷菌、解钾菌和固氮菌功能菌群的数量，不同施肥处理对根际土壤中功能微生物结构组成影响显著（P＜0.05）。在始花期，复合菌剂处理的辣椒根际土壤溶磷菌、解钾菌和固氮菌数量较对照分别提高了7、18和5倍以上，其中CF2-PGPR的解钾菌数比CF1-PGPR高出约1倍（P＜0.05），而溶磷菌和固氮菌在两个处理组间没有显著性差异。在坐果期，处理组的3大类功能微生物数量显著增加，解钾菌和固氮菌数较同期对照分别提高了近3和22倍以上，且解钾菌数在配施100%化肥组表现更为显著，达到8倍以上。在盛果期，功能微生物数仍与对照差异显著，100%化肥配施组的解钾菌数较对照提高近5倍，溶磷菌、解钾菌和固氮菌数均在PGPR复合菌剂配施100%化肥组中更高（P＜0.05）。

表3 PGPR复合菌剂处理对辣椒根际土壤功能微生物的影响 （cfu/g土壤）

3 讨论

辣椒是一年生茄科辣椒属植物，是全球广泛种植的蔬菜经济作物之一，2017年我国辣椒种植面积已超过133.3万hm2［17］。辣椒产业的蓬勃发展使很多学者主要致力于高产品种选育和肥料控释技术的优化，忽视了从根本上通过改善土壤条件及质量达到提高土壤生产力的目的。随着社会对发展生态农业的重视及可持续发展意识的增强，使得以PGPR制成的新型生物肥料部分或逐步取代化肥成为一种可能性。例如，李娟等［18］用解磷微生物菌剂进行油菜盆栽试验，氮肥和氮磷复合肥配施菌剂后油菜生物产量相比未施菌肥分别增加了17.91%，12.0%。Menaviolante等［19］在温室条件对分别以粗砂土和砂壤土为基质种植的番茄接种Bacillus subtilis BEB-13bs，番茄产量提高了21%和25%。本研究中，利用前期分离筛选到的PGPR菌株制备的复合菌剂对辣椒进行灌根，促进了辣椒株高和茎粗的增长，单株挂果数、单株产量及总产量相较于单施化肥均显著增加，其中化肥减量20%后配施PGPR复合菌剂的处理促生效果最为显著。也有相关研究报道适当减少化肥用量可以有效提高作物的产量［20］，这是因为化肥量适当减少，提高了土壤中有效养分含量。

植物的苗期营养生长力的强弱决定了生殖生长的强弱［21-22］。本研究发现，在PGPR菌剂第一次灌根处理后20 d进行辣椒生长指标测定时，辣椒的株高和茎粗均较对照明显增加，这为辣椒挂果数的增加和产量的提升奠定了基础。而在辣椒的坐果期和盛果期，PGPR菌剂处理后的株高与对照并无显著差异，茎粗则显著高于对照，表明株高并不是辣椒产量提高的主要影响因素，这与刘学静［23］研究酵素有机肥对田间辣椒产量的结果一致，类似的研究在番茄［24］和豇豆［25］上均得到了相同结论。因此研究以果实为最终收获物的类似问题时，提示株高并非评价PGPR促生效果的一个必要指标。本研究对辣椒的果长、果径和果形指数等果实指标进行测定，发现3个指标在处理组和对照组之间均无显著性差异，表明PGPR促进辣椒挂果及产量提高的同时，并不会造成果实品质的下降。

根际是土壤中一个特别的区域，根际土壤微生物与植物之间的相互作用，使其与主体土壤在理化性质和生物学特性方面有所不同［26］。研究PGPR对根际土壤微生物群落结构特征的影响具有重要意义。本研究在辣椒始花期、坐果期和盛果期对辣椒根际土壤微生物进行了动态监测，结果显示，PGPR复合菌剂处理后，不同时期辣椒根际土壤细菌总量和微生物总量显著提高，真菌数量明显降低，而放线菌数量在盛果期也显著增加；溶磷菌、固氮菌、解钾菌等功能微生物数量在辣椒各生育期也显著提高。从细菌数量上来看，100%化肥配施PGPR复合菌剂相对优于80%化肥配施PGPR复合菌剂，这可能是100%化肥添加量所引起的土壤化学成分变化不同，刺激了土壤微生物活性提高，从而引起微生物数量增加［27-28］。本研究中PGPR复合菌剂的添加显著减少了真菌数量，这与刘方春等［29］、王其传等［30］的研究结果一致，真菌数量虽然相对于细菌占比较少，但由于其生物量大，易引发植物病变，因此对真菌在土壤中的作用不可忽视［31-32］。放线菌作为一类重要的微生物资源，在控制植物病原菌传播上起着重要的作用［33］。辣椒的盛果期是降雨量增多的7～9月，相关研究表明，许多植物病原菌数量（如炭疽病）与降雨量呈正相关性［34-35］，本研究中坐果期和盛果期根际土壤放线菌数量较对照有不同程度的增高，真菌数量明显降低，表明PGPR复合菌剂的处理对辣椒病害防治可能具有积极作用，这与本研究发现整个种植期间施加复合菌剂的试验田病害更少的结果相符。

近年来已有大量研究报道了PGPR在田间条件下对作物的促生效果，其中许多报道指出外源PGPR可以改变根际土壤中微生物结构和种群数量［29-30，32，36］，且总体变化表现为细菌数量增加，真菌数量减少，放线菌数量变化不一致，与本研究结论相同。但PGPR在田间复杂环境下的促生机制至今仍是个谜，Probanza等［37］曾提出“PGPR改变土壤微生物群落结构是其另一种促生机制”的假说。刘方春等［29］研究发现，施加PGPR生物肥使冬枣根际土壤的微生物总量和细菌数量得到显著提高。邱勤等［38］在研究PGPR对苜蓿生长度土壤微生物的影响时发现，接种PGPR显著促进了土壤微生物生物量碳、氮含量的提高。由此可以推断，本研究采用的PGPR复合菌剂对辣椒根际微生物数量及群落结构的影响，可能是促进辣椒生长和产量提升的重要原因。

4 结论

通过辣椒田间促生试验，表明PGPR复合菌剂在田间条件下能够显著促进辣椒生长，且增产效果明显。

对辣椒根际土壤微生物的动态监测结果表明：PGPR复合菌剂的灌根可以显著提高根际土壤细菌及放线菌数量，降低真菌数量，活化土壤功能菌群，对辣椒根际土壤微生物群落结构具有较大的影响。更深入的作用机制还可通过宏基因组测序分析微生物多样性进行进一步解析。

致谢：感谢遵义山那边生态农业有限公司提供试验用地，感谢贵州大学生命科学学院2016级微生物学专业研究生王欢，生物技术专业2015级本科生杨志芬、吴荣菊、林佳静及石烟祝参与研究工作。