丹参川芎嗪注射液对肺栓塞大鼠P-选择素及组织因子的影响

杨月 刘露 于世寰 范大平 胡天佑

哈尔滨医科大学附属第一医院呼吸监护科150000

肺血栓栓塞症 (pulmonary thromboembolism，PTE)是以血栓阻塞肺动脉而产生的一系列以肺循环和呼吸功能障碍为主的临床综合征。参加全国肺栓塞-深静脉血栓形成防治协作组的205家医院在过去几年中绝大部分医院所诊断的PTE例数呈3～10倍以上的增长[1]。尽管如此，由于PTE的临床变异大，多数PTE患者未能得到及时的诊治，对此应当给予充分关注与研究。PTE的临床症状变异性大，可由无症状至直接猝死，若较大的血栓脱落，阻塞肺动脉主干，70%的患者可死于发病后2 h内。所以，迅速诊断并积极干预是降低PTE病死率的关键。现如今，常见的治疗包括抗凝和溶栓。除此之外，少数效果欠佳的患者还可采取肺动脉血栓摘除术、肺动脉导管碎解和抽吸血栓、放置腔静脉滤器等。以上常规治疗虽可有效地减少肺栓塞的病死率、改善预后，但各有显著的优缺点，治疗效果上也尚需改善，继续寻找其他有效的治疗药物仍是我们所应关注的问题。

组织因子 (tissue factor，TF)和P-选择素(CD62P)可以很好地揭示机体血栓栓塞类疾病的凝血水平，可作为评估体内凝血情况的可靠指标[2-3]。丹参及川芎2种中药成分，因其良好的抗凝作用[4]，在临床已得以使用，尤其用于心绞痛及脑梗死的辅助治疗，虽然已有不少随机对照临床试验验证其对抗血栓的疗效，但仍然缺乏具体证据，更鲜有实验性文献报道两者对肺栓塞发生发展的干预作用。本实验采用与肺栓塞密切相关的TF及CD62P这样具体指标真正意义上地评价丹参川芎合剂对肺栓塞的治疗效果，为合理的药物应用提供更有力的证据。

1 材料与方法

1.1 材料 手术器械及物品：手术剪、手术刀、血管夹、采血针、低速台式离心机、移液管、离心管等。实验试剂：大鼠TF及CD62P酶联免疫吸附测定试剂盒 (品牌：Bluegene，BG，厂家：上海蓝基生物科技有限公司，批号分别是C30651602及C30651603)。主要药物：7%水合氯醛，生理盐水，200 U/ml凝血酶 (黑龙江迪龙制药有限公司，批号20150114)；氨甲环酸氯化钠注射液 (100 ml，1.0 g，长春天诚药业有限公司，批号：2015031013)；依诺肝素钠注射液 (克赛，4000 AxaIU/支，赛诺菲制药有限公司，批号：5SJ28)；丹参川芎嗪注射液 (5 ml/支，吉林四长制药有限公司，批号：20150509)。实验动物：健康雄性Wistar大鼠80只，体质量280～320 g，10～12周(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)。本研究符合 《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 实验动物分组 实验随机分为7 h组及1周组，每组又分为对照组、栓塞组、丹参川芎嗪组、低分子肝素组、联合用药组，每小组8只大鼠(造模失败不计入分组)。

1.2.2 制备栓子 大鼠称重后以7%水合氯醛(0.5 ml/100 g)通过腹腔注射进行麻醉，待疼痛刺激无反应后使其仰卧于木制手术台上，四肢、牙齿固定后，于腹正中线备皮，逐层剪开皮肤、肌肉，轻柔拨开肠管，钝性分离结缔组织，暴露并充分游离腹主动脉下半部，并于大鼠相应部位身下垫一约1 cm高的自制方枕，于髂动脉分叉处上方约1.5～2.0 cm处以血管夹夹闭腹主动脉，使用一次性采血针连接20 ml注射器于髂总动脉分叉上方0.5 cm为穿刺点，朝向近心端方向与血管平行进针约0.8 cm，松开血管夹，进行采血，采血过程中可将木制手术板大鼠头侧垫高，促进血液回流，将采好的动脉血置于含有200 U/ml凝血酶的无菌玻璃平皿中，静置过夜，弃上清后用生理盐水进行冲洗，于4℃冰箱保存。

1.2.3 建立大鼠肺栓塞模型 首先取出一小块制备好的血栓，剪裁成直径约0.5 mm的颗粒状栓子，使用注射器抽取 (25±3)个栓子前连一次性采血针，抽取1.5 ml生理盐水，并使栓子在采血针塑料管中均匀排列，排除气泡备用，将大鼠称重后使用7%水合氯醛 (0.5 ml/100 g)通过腹腔注射进行麻醉，必要时可追加麻药，待疼痛刺激无反应后使其仰卧于木制手术台上，四肢、牙齿固定后，于右侧锁骨中心线上方区域备皮，碘伏消毒，带无菌手套，自制无菌洞巾，于颈动脉搏动最明显、颜色略呈紫色处上提皮肤，剪一长约1.5 cm的纵形切口，小心分离颈静脉上方的结缔组织及肌肉，充分暴露右侧颈静脉壶腹部，使用准备好的采血针沿近心端方向刺入颈静脉，待见到有针尖进入静脉血中开始缓慢推注血栓，推注同时注意观察大鼠呼吸、心跳、口唇颜色变化，推注时间约2 min；注意避免推注过快导致猝死；推注完毕后，拔针按压至无出血，逐层缝合、消毒，观察大鼠是否有呼吸急促、心跳加快等表现，待苏醒后放回鼠笼。对照组推注等量生理盐水，其余步骤同上。若大鼠出现呼吸道分泌物增多或误吸则给予俯卧位、倒立拍背、必要时吸痰等抢救措施。

1.2.4 模型处理 1周组大鼠根据分组分别行相应处理。对照组：生理盐水0.5 ml/d腹腔注射；栓塞组：氨甲环酸12.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射；丹参川芎嗪组：氨甲环酸12.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射+丹参川芎嗪0.9 ml·kg-1·d-1腹腔注射；低分子肝素组：氨甲环酸12.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射+低分子肝素150 IU·kg-1·d-1皮下注射；联合用药组：氨甲环酸12.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射+丹参川芎嗪0.9 ml·kg-1·d-1腹腔注射+低分子肝素150 IU·kg-1·d-1皮下注射。每日取相同时间点进行注射，不同药物注射时间间隔至少1～2 h。

7 h组于栓塞大鼠苏醒后行上述对应处理 (无需注射氨甲环酸防止自身血栓溶解)。

1.2.5 模型取血 各组大鼠根据分组分别于7 h、1周2个时间点进行腹主动脉采血，具体步骤如下：称重后以7%水合氯醛 (0.5 ml/100 g)通过腹腔注射进行麻醉，待疼痛刺激无反应后使其仰卧于木制手术台上，四肢、牙齿固定后，于腹正中线备皮，碘伏消毒，带无菌手套，铺自制无菌洞巾，沿腹正中线逐层剪开皮肤、肌肉，轻柔拨开肠管，钝性分离结缔组织，暴露并充分游离腹主动脉下半部，并于大鼠相应部位身下垫一约1 cm高的自制方枕，于髂动脉分叉处上方约1.5～2.0 cm处以血管夹夹闭腹主动脉，使用一次性采血针于髂动脉分叉上方0.5 cm为穿刺点，朝向近心端方向与血管平行进针约0.8 cm，松开血管夹，同时连接一次性真空采血管 (内含乙二胺四乙酸抗凝剂)，进行采血，采血过程中可将木制手术板大鼠头侧垫高，促进血液回流，留取标本轻轻摇匀后直立静置1 h。采血后的大鼠取出肺组织，观察大体标本。

1.2.6 制备血浆并保存 将留取静置后的动脉血进行离心，离心半径6 cm，2 900 r/min，共15 min。离心后用移液管取上层澄清液移入1.5 ml离心管中，标记后置于-20℃冰箱保存。

1.3 组织大体标本观察、对比 取出肺组织，生理盐水冲洗，置于干净纱布上，标记，进行对比。

1.4 TF及CD62P的检测方法 TF及CD62P均采用双抗体夹心酶联免疫分析法按说明书步骤标准操作测定各孔吸光度 (OD值)。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.5 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据以x-±s表示，各组之间的比较采用单因素变量方差分析，同组不同时间点之间的比较采用配对t检验，两两之间比较采用最小显著性差异法事后检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物表现 注入栓子的大鼠均出现类似急性肺栓塞的表现：呼吸急促、喘憋、分泌物增多、口唇及肢体末端发绀、心率加快、听诊肺部有时可闻及湿啰音或干啰音。

2.2 肺组织大体标本观察 对照组肺组织呈均匀一致的粉红色，表面光滑，膨胀均匀，无出血、坏死组织。栓塞过的肺组织：肺表面明显凹凸不平，有颗粒感，膨胀不均，可见出血点，散在灰白色梗死区域。其中未行药物治疗的栓塞组肺组织病理改变总体较各用药组严重，3个用药组间差异不大。

2.3 TF、CD62P检测结果 7 h及1周后各组大鼠血浆中TF、CD62P浓度见表1、2。结果显示：与对照组相比，栓塞组血浆中TF、CD62P浓度均显著增高 (P值均＜0.05)，提示造模成功。3个用药组与栓塞组相比，TF、CD62P的浓度均有不同程度的降低，并且治疗1周后较7 h比，2者浓度降低的更为明显，但差异无统计学意义。7 h组中，3个用药组血浆中TF浓度与CD62P浓度均较栓塞组降低 (P值均＜0.05)；而用药组间比较，联合用药组TF、CD62P浓度减低更为明显，但差异无统计学意义。1周组中，低分子肝素组和联合用药组与栓塞组比较TF浓度均降低 (P值均＜0.05)；丹参川芎嗪组与栓塞组相比TF浓度差异无统计学意义；3个用药组CD62P浓度较栓塞组均明显降低 (P值均＜0.05)；用药组间比较，联合用药组CD62P浓度减低更为明显，但差异无统计学意义。

3 讨论

急性肺栓塞病死率高，因其起病急、不易发现、致死率及致残率高的特点，及时的发现、诊断并给予积极的干预措施仍应是我们医学者继续深入研究的课题，继续寻找其他有效的治疗药物仍是我们所应关注的问题。

表1 7 h及1周后各组大鼠血浆中组织因子浓度比较 (ng/L，x-±s)

表2 7 h及1周后各组大鼠血浆中P-选择素浓度比较 (ng/L，x-±s)

本实验采用大鼠进行研究，有数量多、实验样本量和时间长度可控、可对较多变量进行统一、大鼠的凝血与纤溶系统接近于人类等诸多优势。既往已有较多实验证实此法可行、可靠[5]。

关于造模成功的依据主要有以下几点：大鼠注入栓子后，均出现呼吸急促、紫绀、心率加快、呼吸道分泌物增多等症状，听诊肺部可闻及啰音，类似临床肺栓塞表现；处死后的大鼠均肉眼可见栓塞过的肺表面明显凹凸不平，有颗粒感，膨胀不均，可见出血点，散在灰白色梗死区域；而且指导该实验的笔者所在科室前辈们均用此方法制作肺栓塞模型并行肺组织病理切片、显微镜观察，充分证实造模方法的可行性。因此，为避免重复及实验成本的不必要浪费，本实验未行病理切片与组织学观察。但经颈静脉注入异体血栓建造肺栓塞的模型确是有据可循。

成功建立该模型过程中有以下几点体会：实验动物体质量一般控制在280～320 g，相对抵抗力强，血管直径较一致，粗细也更适合本实验；操作者一定要进行充分的预实验，具有熟练找准、分离颈静脉并一次穿刺成功的能力；栓子在采血针管中排列间距均匀，匀速推注，避免过快导致大量栓子突然栓塞致大鼠猝死；术后大鼠取侧位摆放，避免仰卧位致分泌物阻塞气管，导致误吸，甚至窒息。

总之，本实验方法可成功并较为简便制备大鼠PTE模型，利于研究，值得推广。

人体血液中存在着多种促凝、抗凝因子，各种因子间相互协调，才能使机体维持在抗凝、促凝平衡的状态。TF是公认的机体内最强的促凝因子之一，分布在大部分的组织细胞，不与循环血接触，而一旦发生炎症、创伤、肿瘤等病理情况，内皮细胞受损，血液接触受损的内皮细胞或从血管里流出，造成血液与TF的直接接触，加之血小板活化表达、产生TF以及循环血中加密的TF解密，随即启动外源性凝血途径[6-7]。因此，可以说血液中TF的增加可提示机体的高凝状态，可作为血栓性疾病的检测指标[8]。

CD62P是一种膜糖蛋白，定位于血小板颗粒内及内皮细胞的Weibel-palade小体中[9]。当机体出现出血、创伤、炎症、肿瘤等多种病理状态时，血小板受到刺激活化，其α颗粒可迅速融合于血小板质膜同时释放糖蛋白CD62P至血小板表面，介导血小板与内皮细胞及中性粒细胞等黏附，最终导致炎症时的组织损伤、止血、血栓的形成与肿瘤转移等多种结果[10-11]。因此，CD62P在血小板表面的表达是血小板活化的特异性标志物，在止血、血栓的形成中起中心环节的重要作用[12-13]。

本实验中，7 h和1周两个时间点，栓塞组TF和CD62P的表达均较对照组明显升高，证明本方法可成功制作大鼠急性肺栓塞模型，也体现了TF、CD62P可以作为提示血液高凝状态的良好指标。

丹参川芎嗪以丹参、川芎2种传统中药制成，临床上，冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死、脑梗死等缺血性疾病已有一定应用[14]，在其辅助治疗上发挥了较好的临床效果[15]，但并未明确表明可用于PTE，其说明书上也未提及可用于治疗肺栓塞。现已有一定量的临床结论证实丹参川芎嗪对抗血栓的疗效，但仍然缺乏具体证据，更鲜有实验性文献报道该合剂对肺栓塞发生发展的干预作用。本实验采用与肺栓塞密切相关的TF及CD62P这样具体指标真正意义上地评价丹参川芎合剂对肺栓塞的治疗效果。实验结果显示，用药7 h后，与栓塞组比较，单独使用丹参川芎注射液或低分子肝素可以有效降低TF、CD62P的浓度，且趋势上低分子肝素效果较为显著；当两者合用时，可进一步降低TF及CD62P的浓度；随着治疗时间的延长，治疗1周后两者浓度降低的趋势更为明显，提示药物治疗有效。在临床上低分子肝素已经成为治疗肺栓塞的一线药物，该实验的结果显示，当在以低分子肝素抗凝为基础的条件下，联合应用丹参川芎嗪，可达到更加理想的治疗效果。

本实验也存在一定的问题，分组时每组只有8只大鼠，样本量较小，而且只选取了7 h、1周2个时间点观察TF、CD62P的变化以评价丹参川芎嗪的药效，由于时间限制等一些客观原因，上述问题未能得以解决。今后将克服、改善实验中存在的以上不足之处，使实验更加完整、充分。

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