高脂饮食对大鼠免疫功能影响及热灭活益生菌改善作用的初探

葛林，张瑜杰，蒲芳芳，王世杰，何方

（1.四川大学华西公共卫生学院四川大学华西第四医院营养与食品卫生学及毒理学系，成都 610041；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，石家庄050221）

0 引 言

随着生活水平的日益提高，我国饮食习惯发生了明显的改变：与过去相比，脂肪与糖类的摄入显著增加。目前认为肥胖、动脉粥样硬化和糖尿病等多种威胁人类健康的慢性疾病的发生都与高脂饮食存在一定关系[1]。有研究表明，高脂饮食导致的代谢异常可引起机体免疫系统功能的异常反应[2]。也有研究认为，高脂饮食将导致正常肠道菌群发生改变[3-4]。已有研究表明副干酪乳杆菌N1115 可以降低LDL-C 水平并改善血脂异常状况[5]，也有研究认为N1115 对缓解非酒精性脂肪肝有作用[6]。但是以上研究均采用活菌N1115 进行研究，故本研究通过长期干预大鼠饮食，检测大鼠生化指标和免疫指标的改变，以初步探究高脂饮食对机体免疫的影响，以及热灭活副干酪乳杆菌N1115的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与受试乳酸菌

受试SPF 级雄性SD 大鼠购自四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所；热灭活副干酪乳杆菌N1115由石家庄君乐宝乳业有限公司提供。

24 只SPF 级雄性SD 大鼠体重约100～140 g，随机分为对照组、高脂组和N1115 组（n=8/组）。饲养温度23±1 ℃，湿度50%～60%，昼夜节律12 h，通风良好。适应性喂养7 d 后，空白组继续饲喂普通饲料，高脂组和N1115组采用高脂饲料喂养。

受试乳酸菌为副干酪乳杆菌N1115（N1115菌）由石家庄君乐宝乳业有限公司提供，N1115 菌是从内蒙古传统乳制品中分离出来的分类学上属副干酪乳杆菌的国产益生菌。研究表明N1115 具有菌株特异性的耐酸耐胆碱盐特性，可以活体形式进入人体肠道内，具有调节肠道微生态及机体的免疫功能的作用。实验前用生理盐水溶解N1115 菌粉，进行65 ℃水浴2 h加热处理，获得热灭活菌N1115菌液

采用灌胃法饲喂热灭活副干酪乳杆菌N1115，按照大鼠体重的1%即1 mL/100 g 灌胃，N1115 浓度为1.4×109CFU / mL。

基础饲料采用GB 配方，高脂饲料配方为：猪油15%、蔗糖20%、蛋黄粉5%、酪蛋白5%、盐3%、胆固醇2%、基础饲料50%。高脂饲料与基础饲料均为粉末状，具体成分见表1，三大营养素热能比见表2。

干预期间每天观察大鼠的一般情况，每天记录各组大鼠的投食量和剩食量，每周计算各组大鼠日平均膳食及能量摄入量。每周测量空腹体重。第0、5、10和18周测量大鼠FBG、TG和TC。第18周时采集5 mL股动、静脉血，静置2 h，2000×g 离心15 min，-80 ℃冻存。脊椎脱臼处死大鼠，取肝、脾、肺、肾周和睾周脂肪称重。

1.2 仪器和试剂

全自动生化分析仪AU400，奥林巴斯（中国）有限公司；通用突变检测系统DCode，伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

基础饲料，成都达硕生物科技有限公司；精制实用猪油，成都中和陆肖油脂厂；蛋黄粉和胆固醇，成都宝信科技有限公司；蔗糖和食盐，市售；Rat Total Adi⁃ponectin/Acrp30 Quantikine ELISA Kit，R&D Systems中国公司；Rat C-reactive protein ELISA Kit，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Rat Adipokine Magnetic Bead Panel 96-Well Plate Assay，默克有限公司（香港）；Luminex®Sheath Fluid，默克有限公司。

表1 基础饲料和高脂高盐饲料配方（g/100 g）

表2 基础饲料和高脂饲料中三大营养素供能比（100 g）

1.3 生化指标检测

取500 μL 血清，采用全自动生化分析仪测定FBG、TG 和TG。

采用ELISA 法检测血清脂联素、血清胰岛素、瘦素、白介素1β（Interleukin 1β IL-1β）、白介素6（Inter⁃leukin 6 IL-6）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis fac⁃tor-α TNF-α）的水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计分析

SPSS 22.0 进行相关数据的统计分析。定量资料统一用均数±标准误（X±SEM）表示。3 次及以上重复测量数据采用重复测量方差分析。在资料正态分布的条件下，若资料方差齐，组间比较采用t 检验；若资料方差不齐，组间比较采用t’检验。在资料非正态分布条件下，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。所有统计检验均为双侧概率检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 摄食量及能量摄入

三组小鼠在第6、11 周摄食量及能量摄入都显著下降，其余时间摄食量及能量摄入情况较稳定。相较于对照组，高脂组和N1115 组日均摄食量明显降低（23.62± 0.37 vs 21.05± 0.30，P＜0.05；23.62± 0.37 vs 21.28±0.33，P＜0.05），但高脂组和N1115 日均能量摄入 显 著 增 高（80.56± 1.63 vs 92.16± 1.30，P＜0.05；80.56±1.63 vs 93.16±1.83，P＜0.05），见图1。

图1 小鼠摄食量及能量摄入情况

2.2 体重及脏器系数

0-18周内三组大鼠的体重均随时间持续增长，但组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。相较于对照组，高脂组和N1115 组的脂体比增高（P＜0.05），高脂组的肝体比有升高趋势，脾体比和肺体比有降低趋势，但组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。相较于对照组，N1115 组肝体比有升高趋势，脾体比有降低趋势，无统计学意义，肺体比降低（P＜0.05），见图3。

图2 小鼠体重变化情况

2.3 血糖及胰岛素

图3 小鼠脏器系数

三组小鼠的空腹血糖值随时间的变化波动，第5周达到高峰，随后逐渐降低。三组间的血糖差异无统计学意义（P＞0.05）。相较于对照组，高脂组的胰岛素有降低趋势，N1115 组的胰岛素有升高趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05），见图4。

2.4 血脂

三组TC 均随时间变化逐渐下降，第0 周时三组间TC 差异无统计学意义（P＞0.05）。但第5 周，第10周和第18 周时，高脂组TC 降低程度均小于对照组(P＜0.05)；第5 周，第10 周时，N1115 组TC 降低程度均小于对照组(P＜0.05)，第18 周N1115 组TC 降低程度与对照组相比无统计学差异，见图5（a）。TG 随时间变化而波动，从第0 周到第10 周逐渐升高，第10 周后又呈下降趋势。相较于对照组，高脂组整体TG 显著升高（0.99±0.04 vs 0.81±0.04, P＜0.05），见图5（b）。

2.5 脂联素、瘦素和细胞因子

图4 小鼠空腹血糖及胰岛素变化情况

图5 小鼠血脂变化情况

高脂组血清脂联素、IL-1β、IL-6 和TNF-α均低于对照组（P＜0.05）。三组间血清瘦素差异无统计学意义（P＞0.05）；见图6。N1115 组血清脂联素和瘦素均高于对照组（P＜0.05），IL-1β 低于对照组（P＜0.05），IL-6 和TNF-α低于对照组，无统计学意义（P＞0.05）。

图6 小鼠脂联素，瘦素及细胞因子检测结果

3 讨 论

目前认为高脂血脂的发生大多与遗传和饮食因素有关，其产生的原因主要有脂类摄入过度、脂代谢异常和脂肪消耗减少。长期高脂饮食能够引发高脂血症，从而对机体健康造成多方面的不利影响甚至引发多种慢性疾病。本研究中使用高脂饲料对SD 大鼠进行长期饮食干预，结果发现大鼠的代谢和免疫都发生了异常改变。

本研究中尽管使用了高脂饮食，但三组大鼠的FBG、胰岛素和体重差异均不具有统计学意义，只有TC 和TG 显著升高。说明该实验中长期高脂饮食仅导致大鼠出现了脂代谢异常，而没有出现糖代谢异常和肥胖。有研究表明高脂饮食会导致大鼠出现食量减少的情况[7]，这可能是导致高脂饮食组并未出现明显肥胖的原因。从结果中也可以看出高脂组的日均能量摄入量高于对照组，但日均摄食量却低于对照组。虽然体重没有明显差异，但高脂组体脂比显著高于对照组，该情况与部分研究使用高脂饮食诱导非酒精性脂肪肝模型的结果相似[8]。本次实验采用的均为正常大鼠而非基因缺陷大鼠进行长期高脂饮食干预，故此结果也说明由于正常个体代谢拥有一定的反馈调节机制，故长期高脂饮对其产生的影响是进行性发展的。同时，高脂组脂联素的显著降低说明长期高脂饮食在不导致肥胖的情况下仍然能引起机体代谢紊乱，且脂代谢紊乱发生先于糖代谢紊乱。

有研究表明肥胖可能引起机体的慢性炎症，导致免疫功能出现异常反应，而这些改变往往存在于肥胖程度较高的动物模型及人群研究中[9-11]。同时，也有研究表明饮食因素引发的肥胖会导致大鼠肺部的免疫系统功能降低[12]。在本次研究中我们发现高脂组血清中的细胞因子IL-6，IL-1β以及TNF-α均低于对照组，且高脂组脾体比相较于对照组有下降趋势。这与之前的研究结果相似，说明长期高脂饮食会导致正常大鼠的免疫系统功能受到抑制。

N1115 是从内蒙地区传统发酵乳制品中提取分离的传统食品由来的乳酸杆菌，在动物及人群实验中，发现N1115 具有菌株特异性地调节机体的免疫及脂代谢的功能[5,13]。同时在细胞实验中，N1115 可介导调节免疫，抑制脂肪细胞的分化、推测菌株特异性地调节机体免疫可能是N1115 影响机体脂代谢的重要机制之一[14]。但是以上均是对N1115 活菌菌体或者是发酵乳的研究，有关灭活的N1115 的研究几乎没有报道过。近来有不少研究已经指出，加热灭活的乳酸菌菌体也具有免疫调节功能[15]。本次研究热灭活的N1115 组TC 和TG 在第0、5、10 周与高脂组升高的趋势相同，第18 周出现明显的下降趋势，趋近于对照组，IL-1β，IL-6 和TNF-α低于对照组，说明热灭活的N1115 具有调节脂代谢和免疫功能的作用，证明了灭活菌的功效和活菌几乎相同，但是相关机制和相关成分还需要在今后的研究中继续探索。

综上，我们发现长期高脂饮食将会引起机体代谢功能和免疫系统的异常。在导致肥胖之前就可以引发脂代谢异常，并抑制机体免疫系统活性。而热灭活的副干酪乳杆菌N1115 可以改善高脂饮食诱导的脂代谢异常、和缓解高脂饮食引起的机体免疫功能的下降。