基于计算机模拟技术优化筛选核酸适配体的初探

刘 冰 吴秋月 高 进 赵耀帅 杨艳玲 王 硕

（食品营养与安全国家重点实验室 食品营养与安全教育部重点实验室天津科技大学食品科学与工程学院 天津300457）

适配体是可以折叠成明确三维结构的一段寡核苷酸序列，通过空间构型互补与靶分子高特异性结合，以短的单链寡核苷酸序列（单链DNA 或RNA）为主。当目标物存在时，适配体通过自适应的构象变化和三维折叠成的茎、发夹环、四角环、假结体和三重体等固定的结构基元，与目标物进行特异性结合[1-2]。适配体和靶分子间的作用包括：性状互补、适配体的碱基堆积作用、带点基团静电作用和氢键作用等，核酸适配体在检测方面主要是作为分子识别元件来特异性识别目标物[3-4]。适配体较抗体有诸多优点：成本低、稳定性好、易于修饰等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，已广泛应用于检测、分离纯化和医疗三大领域[5-8]。

1990年，Tuerk 和Gold[9]提出了一种新的体外筛选和扩增方法，命名为SELEX（指数级富集的配体系统进化）。雷兆静[10]通过15 轮长时间的SELEX 筛选机制筛出毒死蜱单链DNA 适配体，筛选效率为44%。周静[11]将分离纯化后的Dxl6N-GST融合蛋白与RNA 文库在一定条件下孵育结合，共进行6 轮SELEX 筛选，得到Dx16 基因。Shang等[12]利用cell-SELEX 技术反向筛选出1 组适配体特异识别白血病细胞。SELEX 一般需要多达数十轮的筛选过程，操作较为复杂，程序繁琐。初始序列库尽管可包括1 016 个序列，在序列空间中仅为很小的一部分。SELEX 的筛选机制尚不够明确，通常被认为是黑箱机制（black box）。目前，适配体序列的优化仍没有更好的研究手段[13]。

Choi 等[14]从晶体结构的角度揭示了疟原虫乳酸脱氢酶及其适配体的复合物显示的独特的性质：通常在不成对核苷酸和蛋白质之间存在广泛的分子间氢键用于特定识别。近年来分子模拟技术发展迅速并在多个学科领域得到广泛的应用。分子对接就是配体与受体按照几何匹配、能量匹配以及化学环境匹配的原则找到两者最好的结合模式[15-16]。分子对接方法可以构建目标受体（例如蛋白）和底物（例如小分子）的复合物结构模型，并对复合物的结构进行合理性评价，推测出能影响受体作用机制的关键位点，是联系蛋白质结构与其生物功能的桥梁之一。从对接结果中，可以清晰地看出与小分子作用的关键氨基酸和基团。从这一意义来说分子对接的实质就是通过优化算法来搜寻配体和受体的最稳定结合构象的过程[16]。

CDOCKER 是基于CHARMm 力场的分子对接方法，分别对受体AMP 和适配体S0 赋予CHARMm 力场，这种方法可以产生高精度的对接结果。在分子力场的作用下，通过一定的算法，找到体系能量最小的构象，也就是说分子力学是一种求能量最小的方法[17]。在分子力场之下，分子内部的化学键的键长、键角等都会自我调整，是其处于最自然的状态，也同时使得非键相互作用处于能量最小的状态，以此获得原子的最佳分布[18]。根据体系的结合自由能的大小判断核酸突变后是否趋于利于结合的方向改进，能量越小，体系越稳定[19]。

本文利用分子模拟技术探究适配体及其目标物微观结合的性质，进行核酸适配体的优化筛选。使用计算机辅助软件将原始适配体和突变后的适配体与其小分子目标物进行分子对接，比较对接后的结合自由能，寻找突变后的最优核酸适配体。根据胶体金的可视化试验对结果进行验证，筛选得到最佳的突变适配体。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在苏州金唯智生物科技有限公司合成AMP的适配体序列即原始适配体S0：5'-GGGAAGA AACUGUAGC-3' 和突变适配体S4：5'-GGGAG UCAACUGUAUC-3'（瞬时离心后用0.1% 的RNase-free Water 溶解）；氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸三钠购自美国Sigma 公司；AMP 购于北京华夏雄风科技有限公司；NaCl 等其它试剂均购于上海化学试剂公司。试验所用试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

Discovery Studio 2016，BIOVIA；Precision T7810系列工作站，美国Dell 公司；紫外分光光度计，美国Thermo 公司；涡旋混合器，北方同正公司；电热鼓风干燥箱，上海洪欣实验仪器公司；超纯水系统，美国Millipore 公司；冰箱，海尔公司；酶标仪，美国Thermo 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 模拟试验流程 从PDB 数据库中找到RNA-AMP 复合物（PDB CODE：1AM0），AMP 的原始适配体的 RNA 序列为 GGGAAGAAACUGUAGC，将其命名为S0，共包含16 个碱基，通过查阅文献及Discovery Studio 结构显示可知，共有7 个关键碱基（Key Base）[20]，分别是G7、G8、A9、A10、G11、A12 和G34。

将S0 与AMP 进行分子对接，得结合构象的结合自由能，以此为基础，进行第一轮突变筛选。RNA 的碱基主要有4 种碱基，分别是A 腺嘌呤、G鸟嘌呤、C 胞嘧啶和U 尿嘧啶。如图1所示，对原始适配体S0 进行单点定向突变，在第一轮突变中，对7 个碱基分别进行3 次突变后，与目标物AMP 进行分子对接，比较结合能的大小：能量越小，结构越稳定，确定优化后的第1 个碱基，选择突变后结合能最小的RNA 链即为S1，作为第1轮优化的结果和第2 轮优化的基础。

在第2 轮优化中，根据第1 轮确定的S1 对余下6 个碱基进行3 次突变，再次与AMP 进行分子对接，比较结合能的大小后，确定优化后的第2 个碱基，本轮中突变后结合能最小的RNA 链即为S2，作为第2 轮优化的结果和第3 轮优化的基础。

重复上述工作，直至结合能不再减小，说明突变不再向利于两者结合的方向前进，此时，停止突变，最后一轮实现了优化目的的适配体即为S4，是最终的最佳适配体，下面利用胶体金的可视化检测对结果进行验证。

1.3.2 胶体金的制备 试验采用柠檬酸三钠还原法[21]制备胶体金，在锥形瓶中加入100 mL 超纯水，划线取出1 mL 后弃去；再加入1 mL 质量分数为1%的氯金酸溶液，磁力、回流加热搅拌，持续煮沸10 min，然后在持续沸腾的情况下迅速加入2.25 mL 质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，溶液颜色在1 min 内变红，待颜色不再改变时，继续沸腾20 min 后，置于无热搅拌器上，搅拌状态下自然冷却至室温，得到的酒红色液体，即为胶体金，需避光、密封、4 ℃保存。通过紫外对其进行表征：在520 nm 处有最大吸收峰。

1.3.3 胶体金的可视化检测 取50 μL 浓度为10 μmol/L 的AMP 适配体RNA 溶液，加入96 孔板中，再加入50 μL 不同质量浓度（0，0.025，0.4，2，4，10 ng/mL）的目标物，混匀孵育5 min 后，加入50 μL 的胶体金，平衡5 min 后，加入10 μL 浓度为2 mol/L 的NaCl 溶液，再次平衡孵育5 min 后，400 nm 到750 nm 进行吸光光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 模拟筛选

使用计算机辅助软件Discovery Studio 的Mutate 模块对重要位置上碱基的定向单点突变，每个碱基向RNA 进行多轮迭代定向突变后，与原始适配体S0 与AMP 的分子对接结果进行结合自由能的大小比较，结合自由能值越低，证明其结合效果越好。如图2，是原始适配体S0 与AMP 的分子对接结果图，此时，两者的结合能大小为-19.23 kcal·mol-1。

图1 筛选流程示意图Fig.1 The schematic diagram of the screening process

图2 S0 与AMP 分子对接结果Fig.2 The result of molecular docking for S0 and AMP

表1 5 轮优化过程中结合自由能的大小Table 1 The free energy in the five wheel optimization process

如表1，第1 轮突变结果显示，当对所有碱基进行单点突变后，G34 突变为U34 后结合能最小，为-22.60 kcal·mol-1，将原适配体S0 中的G34 改为U34 即GGGAAGAAACUGUAUC（S1）；以此为基础，对S1 进行第2 轮突变，当A12 突变为C12后，结合能最小，为-24.09 kcal·mol-1，将S1 中的A12 改 为C12 即GGGAAGCAACUGUAUC（S2）；对S2 进行第3 轮突变，当G11 突变为U11 后，结合能最小，为-25.75 kcal·mol-1，将S2 中的G11 改为U11 即GGGAAUCAACUGUAUC（S3）；对S3 进行第4 轮突变，当A10 突变为G10 后，结合能最小，为-26.05 kcal·mol-1，将S3 中的A10 改为G10即GGGAGUCAACUGUAUC（S4）。迭代优化至S4，继续对S4 进行第5 轮筛选时发现能量最低的一次突变是将A9 变为C9，此时结合能最小为-25.20 kcal·mol-1，明显大于S4 与AMP 的结合能量-26.05 kcal·mol-1，说明此轮突变并没达到提高适配体与AMP 的结合能力的目的，故对AMP核酸适配体来说，优化的最佳结果为S4。如图3，是S4 与AMP 的分子对接结果示意图。

图3 S4 与AMP 分子对接结果Fig.3 The result of molecular docking for S4 and AMP

总结以上模拟优化筛选过程，原始适配体S0经多轮迭代优化筛选后得到的适配体及其与目标物作用时的结合自由能见表2。

表2 原始适配体及优化后的适配体序列Table 2 The original aptamer sequence and the optimized aptamer sequences

2.2 试验验证

基于胶体金溶液在高浓度NaCl 的作用下产生的凝聚而造成的颜色变化[22]，利用酶标仪对溶液的吸收光谱进行测定。

胶体金经由柠檬酸三钠还原氯金酸制备而成，生成的溶液是一种胶体溶液，胶体金表面覆盖一层柠檬酸，颗粒之间通过静电排斥作用保持胶体金溶液的稳定性，如果在溶液中加入高浓度的盐，即可破坏胶体溶液的稳定性，胶体金发生凝聚，溶液颜色由红色变为蓝色。当溶液中遇到靶分子AMP 时，适配体特定的三维结构与其相结合，表面没有吸附适配体的胶体金再加入高浓度的盐后，胶体金发生凝聚，溶液变为蓝色。胶体金团聚程度增大，其颜色会相应呈现红-紫-蓝的变化，从而实现可视化检测[23]。在两者结合效果更好的情况下，溶液蓝色加深且胶体金的吸收峰增加。

为验证模拟结果，将原始适配体S0 与模拟优化筛选的最佳适配体S4 分别AMP 进行胶体金的可视化检测，吸光光谱扫描结果如图4。

图4表示体系在不同目标物浓度下的吸收光谱，S4 与S0 相比，在520 nm 处胶体金的吸收峰更高，由此可定性分析出对原始的适配体优化后的最佳适配体S4 比原始适配体S0 对目标物的结合能力更强，该结果与计算机模拟筛选结果一致性良好。

3 总结

图4 S0 与S4 不同浓度下的吸收光谱图（浓度范围0，0.025，0.4，2，4，10 ng/mL）Fig.4 Absorption spectra of the system at different concentrations of the target with S0 and S4 （Concentration：0，0.025，0.4，2，4，10 ng/mL）

总之，使用计算机模拟技术，对AMP 的原始适配体S0 进行迭代单点突变，比较突变后新适配体序列与AMP 分子对接后结合自由能的大小，选择结合能更小的适配体，经多轮迭代筛选后，将原始适配体S0 和最佳突变适配体S4，通过胶体金的可视化检测试验进行验证，一致性良好。试验方法可以实现适配体优化筛选的目的，为今后的适配体筛选工作提供了理论基础。