蠕形螨对共培养HaCaT 细胞的TLR2以及炎症相关基因表达的影响

胡丽, 赵亚娥∗, 熊国典, 张又仁, 王昊若, 刘博

酒渣鼻是一种常见的慢性炎症性皮肤病，患者主要表现为以鼻为中心的面部潮红、毛细血管扩张、丘疹、脓疱等，严重损害患者容貌。 由于缺乏特效药，使得该病经久不愈、反复发作，患者长期承受精神和心理压力，产生焦虑、抑郁等不良情绪[1]，甚至出现全身系统性疾病[2]，对生活质量造成很大影响。 目前酒渣鼻的病因和发病机制尚不完全明确，已有的研究认为遗传、饮食、日晒、激素分泌、化妆品、蠕形螨等多种因素与酒渣鼻的发生有关[3]。 表皮作为人体抵御外界刺激的第一道屏障，90%以上为角质形成细胞，通过表达多种模式识别受体，识别病原体相关分子模式(PAMPs)，发挥介导和调节免疫反应的功能[4]。 最新研究发现，酒渣鼻患者表皮角质细胞Toll 样受体2(TLR2)的表达量显著高于面部健康人，并且继发激肽释放酶5(KLK5)表达增加，最终活化抗菌肽表达而出现酒渣鼻的临床症状[5，6]。 因此，目前普遍认为异常增高的TLR2 很可能是酒渣鼻发病的关键因素。

蠕形螨是引起蠕形螨样酒渣鼻发生的重要危险因素，这在我们前期研究中已经确认[7-9]。 然而，蠕形螨引起酒渣鼻的致病机制并不完全清楚。 为了探究蠕形螨能否诱发角质形成细胞表达TLR2，能否进一步活化TLR2 诱导相关炎性因子的释放，本研究选择毛囊蠕形螨为研究对象，使之与人永生化角质形成细胞(HaCaT 细胞)建立共培养体系，通过虫数梯度刺激实验，观察螨虫数量与HaCaT 细胞表达TLR2 以及相关炎性因子之间的关联性，揭示蠕形螨数量与TLR2 以及酒渣鼻发生之间的潜在关系。

材料与方法

1 材料

1.1 螨虫收集与细胞获取 采用透明胶带粘贴法自陕西西安人面部皮肤收集毛囊蠕形螨成虫[8]。HaCaT 细胞由西安交通大学第二附属医院皮肤病院赠予，保存于-196℃液氮罐中。

1.2 主要仪器与试剂 二氧化碳细胞培养箱(Memmer，德国)；超净工作台(泰斯特，中国)；倒置显微镜(Thermal Fisher，美国)；微量酶标仪(Thermal Fisher，美国)；普通PCR 仪(ABI，Thermo scientific，美 国)； 实 时 定 量 PCR 仪( Agilent StrataGene Mx3005P，美国)；胎牛血清(BI，以色列)；青链霉素混合液(思科捷，中国)；DMEM 高糖培养基和0.25%胰酶(Gibco， Thermo scientific，美国)；RNA提取试剂盒(Qiagen，美国)；逆转录试剂盒和qRTPCR 试剂盒(艾科瑞，中国)。

2 方法

2.1 细胞复苏与培养 将HaCaT 细胞株自液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中水浴1～2 min；然后转移至15 mL 离心管，加入9 mL 完全培养基(DMEM 高糖培养基+10%胎牛血清+1%谷氨酰胺替代物+1%青链霉素)，离心弃上清；最后，重新加入1 mL 完全培养基吹打混匀，按照1 ∶3 比例传代。置于37℃含5% CO2及95%空气饱和湿度的细胞培养箱中培养。 细胞稳定传代后，倒置显微镜下观察细胞状态良好，即可用于实验。

2.2 实验分组与处理 采用台盼蓝染色计数法，取2×104活细胞均匀铺至96 孔板中，置于细胞培养箱中培养；待细胞过夜贴壁后，用自制取螨针自透明胶带分别挑取10 只、30 只和50 只活的毛囊蠕形螨成虫于HaCaT 细胞完全培养液中，未加入螨虫的HaCaT 细胞作为空白对照；在二氧化碳细胞培养箱中培养24 h。 每组3 个重复。

2.3 细胞RNA 提取与反转录 螨虫与HaCaT 细胞共培养24 h 后，弃去培养液，PBS 洗涤细胞两次，倒置显微镜下确认无螨虫；然后加入细胞裂解液，采用刮取法将贴壁的HaCaT 细胞自培养板刮下，按照试剂盒说明书提取RNA，微量酶标仪检测RNA 浓度和质量；最后，依据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，-20℃保存备用。

2.4 引物设计与序列检测 采用Primer premier 5.0 设计内参基因β-肌动蛋白(ACTB)186 bp(模板NM_001101；上游:5’ -TGGCACCCAGCACAAT GAA- 3’，下 游:5’ - CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA-3’)与待检测目的基因TLR2、KLK5、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8 和趋化因子配体2(CCL2)的qRT-PCR 引物(表1)。 采用常规PCR扩增各基因，纯化回收PCR 产物进行克隆与测序，序列比对确认一致性[10]。

2.5 qRT-PCR 检测 反应体系20 μL，包括2×SYBR Premix 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μM)各0.4 μL，ROX(4 μM)0.4 μL，无菌水补足。 反应程序采用试剂盒推荐的两步法，即预变性95℃ 30 s，1 个循环；95℃ 15 s 变性，60℃ 30 s 退火、延伸，40 个循环；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，1个循环，做熔解曲线。 为了保证结果的可信性，每个处理组3 个样本，每个样本3 个复孔。 最后，选择2-△△CT法，根据CT 值计算各基因相对内参基因的表达量。

2. 6 数据分析 采用 SPSS 18. 0 和GraphPad Prism 7.0 软件进行数据分析，结果以均数±标准差(±s)表示。 采用单因素方差分析进行多组间差异分析，然后两两比较各组间差异，方差齐采用LSD-t检验。 采用Pearson相关性分析法分析表达量与虫数之间的相关性，以相关系数(r)代表相关强度，绝对值越接近1 说明相关性越强。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 螨虫与HaCaT 细胞共培养体系建立

图1A 为HaCaT 细胞经1 ∶3 传代培养两天的贴壁状态，可见细胞呈扁平状、不规格多角形，界限清晰；胞浆均匀，细胞核呈圆形位于细胞中央；细胞之间紧密相连，细胞状态良好，满足共培养细胞的条件。 图1B 为HaCaT 细胞与活的毛囊蠕形螨共培养24 h，螨虫活动度好，颚体与足体活动自如，表明共培养体系构建成功。

2 RNA 质量评估与基因序列检测

酶标仪检测显示，RNA 浓度在30 ng/μL 左右，OD260/OD280在1.8 ～2.1 之间；特异性引物PCR 电泳显示，ACTB、TLR2、KLK5、IL-1β、IL-6、IL-8 和CCL2 产物大小符合预期，条带清晰，无引物二聚体，未出现非特异性扩增(图2)；测序结果比对显示，插入片段与相应模板序列完全一致，无突变碱基(图3)，表明本次提取的RNA 质量和设计的特异性引物均满足后续qRT-PCR 检测的要求。

3 目的基因qRT-PCR 检测

图4 显示，目的基因qRT-PCR 扩增曲线平整呈“S 型”，复孔重复性好，阴性对照无扩增， 表明加样准确且无污染；熔解曲线显示各基因解链温度在83～89℃之间，均为单峰，不存在引物二聚体或非特异性扩增，说明产物特异性好，定量结果准确。qRT-PCR 结果显示(图5、图6和表2)，虽然六个目的基因的相对mRNA表达量在10 只螨虫组与空白组差异无统计学意义，但TLR2 和KLK5表达量与虫数呈正相关，相关性有统计学意义(r=0.984 和0.974，P＜0.05)。30只螨虫组TLR2 表达量明显高于10 只螨虫组和空白组(t=6.35和6.54，P＜0.001)；50只螨虫组高于30只螨虫组(t=4.31，P=0.003)。30只螨虫组KLK5只高于空白组(t=3.31，P=0.011)，不高于10 只组；但50只螨虫组高于10 只螨虫组(t=2.79，P=0.024)。炎症相关因子IL-6、IL-8和CCL2 表达量与虫数也呈明显正相关(r=0.970、0.984 和0.985，P＜0.05)，IL-1β相关性不显著(r=0.938，P＞0.05)。在IL-6，表达量随虫数变化上调最明显，50 只螨虫组、30只螨虫组和10只螨虫组两两之间的差异均有统计学意义。在IL-8，50只螨虫组和30 只螨虫组均明显高于10只螨虫组和空白组，但50只组和30只组之间的差异无统计学意义(t=1.64，P=0.139)。在CCL2，50只螨虫组与10只螨虫组和空白组的差异有统计学意义(t=3.09，P=0.015；t=4.03，P=0.04)，30只螨虫组与空白组差异也有统计学意义(t=3.12，P=0.014)，但其他各组两两比较差异无统计学意义。在IL-1β，随虫数增加表达量变化更小，只有50 只螨虫组与空白组差异有统计学意义(t=2.60，P=0.032)。

表1 目的基因引物信息

图1共培养前的HaCaT 细胞形态(A)与共培养24 h后的螨虫形态(B)

图2 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图

图3基因序列比对

图4 qRT-PCR 扩增曲线(A-C，G-I)和熔解曲线(D-F，J-L)

图5共培养24 h后细胞TLR2与炎症相关基因表达量比较

图6目的基因表达量与螨虫数量的线性相关分析

表2目的基因表达量与虫数的相关性

讨论

蠕形螨病是近年来才确认的螨源性面部皮肤病，以毛囊糠疹、丘疹脓疱、结节肉芽肿等为典型皮肤损害，主要表现为酒渣鼻、痤疮、毛囊炎、口周炎、脂溢性皮炎、睑缘炎等[9]临床症状。然而，由于蠕形螨寄生具有种的特异性，动物模型的构建尚未见报道，郭霍法则无法直接验证其致病性；螨虫虫体微小，虫源获取困难，DNA[11]、RNA[12]和蛋白[13]等分子水平的研究也长期面临挑战，这些直接限制了蠕形螨分子致病机制的研究。在此背景下，本研究首次选用HaCaT 细胞与毛囊蠕形螨共培养，旨在分子水平揭示蠕形螨对宿主角质细胞免疫反应的影响，具有以下三个亮点:一是改进细胞共培养模型，首次建立的毛囊蠕形螨与HaCaT 细胞共培养模型，替代了与皮脂腺细胞共培养模型，使得模型更接近毛囊蠕形螨在人体的微环境；二是采用虫数梯度实验，qRT-PCR 检测细胞TLR2 和炎症相关基因表达量变化，揭示蠕形螨虫数与共培养细胞炎性因子间的数量效应关系；三是实验螨虫均取自相同宿主，避免了来自不同宿主螨虫可能存在的差异，使得结果更具说服力。因此，本研究的完成对于今后继续深入研究蠕形螨与皮肤病发生的分子机制提供了新思路。

共培养起源于20世纪80 年代后期，最初是将人的两种或两种以上细胞共同培养于同一环境中，目的是为了最大程度模拟人体正常的生理或病理状态，弥补无法直接在人体进行实验研究的缺陷。之后逐渐拓展到微生物与细胞共培养，对于难以建立动物模型的病原体致病机制的研究提供了启示。蠕形螨是寄生在人面部的常见病原体，目前不能动物培养，缺乏动物模型。然而，幸运的是，2018年Lacey 等人[14]首次尝试将毛囊蠕形螨与皮脂腺细胞进行共培养，目的是探讨蠕形螨在酒渣鼻中可能的致病作用。结果显示，尽管TLR2、IL-1β和IL-6 等多种炎性因子在处理组与空白组的差异均无统计学意义，但IL-8和IL-10表达量在处理组与空白组的差异有统计学意义。这一研究设计引起了我们极大的兴趣，我们认为出现大部分阴性结果的原因可能是与毛囊蠕形螨共培养的细胞选择皮脂腺细胞不当有关。因为人毛囊蠕形螨主要寄生在毛囊漏斗部，而人皮脂蠕形螨主要寄生在皮脂腺内。要建立与毛囊蠕形螨共培养的细胞模型，应该选择角质形成细胞而非皮脂腺细胞。因此，本研究首次选用人永生化角质形成细胞(HaCaT 细胞)替代了皮脂腺细胞，与毛囊蠕形螨共培养，培养环境应该更接近毛囊蠕形螨在人体的寄生环境，从而得到了预期的实验结果。

酒渣鼻的发生与TLR2和KLK5的异常表达和活化有关，本研究也得到了相似的实验结果。 TLR2和KLK5表达量与虫数呈明显正相关，尤其是TLR2表达量随虫数上调更明显，当螨虫数为30只时，表达量与空白组差异有统计学意义(2.84±0.34 vs 1.01±0.16)，50 只螨虫时差异更明显(4.05±0.57 vs 1.01±0.16)，这一结果与文献报道的毛囊蠕形螨≥5只/毛囊(或/cm2皮肤)的蠕形螨病诊断标准相互印证[15]。可能的解释是，随着螨虫数量的增加，毛囊蠕形螨的分泌物或者代谢产物作为TLR2的PAMPs，刺激共培养的HaCaT 细胞TLR2表达增加，炎症反应加强。这一结果可以部分解释蠕形螨先天性缺乏免疫的酒渣鼻患者，蠕形螨大量繁殖引起严重的临床症状，而在免疫功能正常的健康人，蠕形螨感染度低且鲜有临床症状[16]。

TLR2表达增高会引起多种炎性因子表达增高[17]，本研究选择前炎性因子IL-1β和IL-6以及趋化因子IL-8和CCL2进行了进一步检测。IL-1β和IL-6均能够刺激B细胞活化增殖分泌抗体，T 细胞增殖以及细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)活化，发挥免疫调节和介导炎症作用；IL-8主要功能是吸引和激活中性粒细胞定向游走到反应部位并释放一系列活性物质，导致机体局部炎症反应；CCL2则能够趋化单核/巨噬细胞和T 淋巴细胞到炎症部位，增强炎症反应。本次qRT-PCR 检测发现，四种炎性因子的表达量也与虫数呈正相关。在两个前炎性因子，IL-6变化明显强于IL-1β，50只螨虫组与空白组的差异有统计学意义(2.27±0.13 vs 1.00±0.03；1.28±0.21 vs 1.00±0.09)，但30只螨虫组只在IL-6 明显上调(2.04±0.09 vs 1.25±0.07)。在两个趋化因子IL-8和CCL2，IL-8变化强度强于CCL2，虽然两者变化幅度没有前炎性因子IL-6强，但是明显强于IL-1β。这表明蠕形螨首先刺激TLR2 激活后，对这四种炎性因子的表达调控有所差异，从强到弱依次为IL-6、IL-8、CCL2 和IL-1β。

我们尝试建立的毛囊蠕形螨与HaCaT 细胞共培养模型优于毛囊蠕形螨与皮脂腺细胞共培养模型，TLR2 和IL-6 变化最明显。本研究首次从细胞水平揭示皮肤免疫反应与蠕形螨感染数量有关，当感染的毛囊蠕形螨数量较多时，TLR2显著上调，继而激活相关信号通路，引起下游IL-6、IL-8、CCL2和IL-1β等炎性因子表达增加，参与皮肤损伤，导致蠕形螨病的发生。本研究作为毛囊蠕形螨与HaCaT 细胞第一次共培养的探索性实验，虽然存在局限性，但对于揭示蠕形螨在酒渣鼻中的致病作用以及酒渣鼻分子发病机制的研究提供了新思路。