18F-FMISO PET显像评价结直肠癌肝转移的实验研究

张茗昱 姜昊 张荣军 王振常 姜慧杰

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见的癌症［1］。肝脏是 CRC转移最常见的部位，结直肠癌肝转移（colorectal liver metastasis，CLM）是影响患者生存率的关键因素［2］。肿瘤转移行为取决于肿瘤的遗传和微环境异质性，肿瘤异质性与其生物学行为、临床表现、预后和治疗反应息息相关［3,4］。CRC转移与否直接影响临床治疗决策，分子显像可以活体、无创、动态评估CRC的生物学行为，被认为是指导CRC个体化治疗的必要手段。

实体肿瘤的快速生长导致了组织内氧供不足［5］，肿瘤乏氧与预后不良、侵袭性增强、血管生成、肿瘤浸润、肿瘤转移及放化疗抵抗密切相关［6,7］。在CRC患者中，肿瘤乏氧程度及乏氧区域决定了其转移潜能，准确评估肿瘤组织的乏氧状态可以有助于了解肿瘤生物学特性［8］。正电子发射显像（positron emission tomography，PET）是一种无创的功能成像方法，PET定量参数可以提供肿瘤空间异质性有关的信息，基于PET的肿瘤乏氧显像促进了我们在分子水平上对肿瘤生物学行为的理解，并有助于早期个体化治疗方案的制定［9,10］。18FFMISO示踪剂是检测和量化肿瘤乏氧最常见的示踪剂［11,12］。18F-FMISO属于亲脂性，容易穿过细胞膜并扩散到组织中，同时受血流影响小，并可选择性的在低氧细胞中结合，其2 h后的摄取分布可以准确反映氧供不足的区域［11,13］，标准化摄取值（standardized uptake value，SUV）是18F-FMISO PET的定量参数，可用于量化肿瘤内低氧水平状况。目前，18F-FMISO显像已应用于胶质母细胞瘤、头颈癌、肺癌及乳腺癌等疾病中的诊断、评估生物学侵袭区域及预测预后［14-18］。然而，基于18F-FMISO显像预测CRC异种移植小鼠模型转移潜能的研究尚未报道。

本研究的目的是探究不同转移潜能CRC细胞系（LoVo、HT29和 HCT116）的肝转移生物学行为，基于细胞和动物水平分别从体外、体内进行18F-FMISO摄取和生物学指标的相关性进行研究。本研究有助于更好地了解CRC生物学行为，并发现用于指导个性化治疗所需的影像指标。

资料与方法

1.细胞培养

人CRC细胞系LoVo、HT29和HCT116购于中科院上海细胞库。LoVo细胞系培养于DMEM（Gibco Corporation，USA） 培养基中，HT29 和HCT116细胞系培养于McCoy's 5A培养基（Gibco Corporation，USA）中。所有培养基中加入10%的胎牛血清（Hyclone，USA）和 1%的青-链霉素（Beyotime Biotechnology，China）。细胞乏氧时，使用常规培养基，将细胞置于含 1%O2、5%CO2和 94%N2的乏氧培养箱中孵育24 h，孵育温度37℃。

2.CLM小鼠模型及CRC皮下异种移植小鼠模型的建立

选取 5周龄的BALA/C裸鼠（体重 16～18 g），购于常州卡文斯动物实验公司（常州，中国）。种植前3天所有实验动物适应性饲养于无菌室。动物室温和相对湿度分别设定在24℃和（55±10）%。动物研究按照江苏省原子医学研究所动物管理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。肝转移模型的建立方法是将LoVo，HT29和HCT116细胞悬液（5.0×106/0.15 ml）注射到麻醉的（混入纯氧中的2%异氟烷）裸小鼠脾脏内，同时保留脾脏，从而诱发肝转移的发生。皮下异种移植模型的建立方法是 将 LoVo（5×106）、HT29（5×106）及 HCT116（5×106）细胞悬液注射于左前肢皮下。手术完成后，每三天记录一次裸鼠的体重，Micro-PET显像后处死小鼠。

3.体外细胞摄取实验

18F-FMISO细胞摄取实验前，三种细胞需置于乏氧环境下进行预处理。CRC细胞、18F-FMISO示踪剂和缓冲液（含0.2%牛血清白蛋白的DMEM）加入到2 ml玻璃试管中混合，在37°C条件下分别孵育 30、60、120和 240 min。 自行标记 O管、T管、X管。其中O管（对照组）：加入100 μl放射性核素和 200 μl缓冲液；T管： 仅加入 100 μl放射性核素用于测量放射性核素剂量；X管：加入100 μl放射性核素，100 μl细胞悬液和100 μl缓冲液。细胞数量为5×105个/管。孵育结束后，1000 rpm/min离心5 min，吸出O管和X管中的所有液体。采用自动伽马计数器（PerkinElmer，2480，USA）测量不同时间点每个中试管中的放射性计数。细胞体外核素摄取率：X（cpm）-0（cpm）/T（cpm）%。

4.18F-FMISO示踪剂的合成

用于18F-FMISO合成的多功能模块购于无锡市江源工业技术贸易公司，按文献的步骤进行合成［19］。18F-FMISO示踪剂的放射化学纯度均大于95%，最终比活度大于0.5 TBq/mmol。用于动物实验的18F标记的示踪剂在生理盐水中配制并通过0.22 μm Millipore 过滤。

5.Micro-PET显像及定量分析

CLM模型建立7周后、皮下异种移植瘤体积达1 cm3后行18F-FMISO Micro-PET显像，使用3D Inveon Micro-PET 扫描仪（Siemens）采集小鼠Micro-PET图像。使用Inveon Acquisition Workplace工作站（Version 2.0，Siemens）进行基于有序子集期望最大化的图像重组，矩阵：128×128×159；像素尺寸：0.86 mm×0.86 mm×0.8 mm；β 值为 1.5，分辨率均匀。PET显像前，所有小鼠用含2%异氟烷的纯氧麻醉，经尾静脉注射18F-FMISO（约14.8 MBq，400μCi）。所有图像均使用ASI Pro VM 6.8.6.9图像处理软件进行兴趣区域的勾勒，肿瘤兴趣区的勾勒尽可能包括整个肝脏转移灶。计算最大标准化摄取值（SUVmax）定量评估肝转移瘤放射性核素的摄取。SUVmax的计算公式为：

6.伤口愈合实验

将 LoVo、HT29和 HCT116细胞以 5×105个/ml的浓度接种在无菌6孔板中，待每种细胞生长至单层铺满时采用10 μl移液枪头尖部划伤单层细胞以创建伤口缝隙。在Olympus IX71显微镜（Olympus，Japan）下采集划痕后 0 h 的图像，第一次图像采集后，用含2%FBS的低血清培养基处理细胞，于伤口创建后24和48 h采集划痕图像。整个图像采集过程使用相同的视野，以保证位置的一致性。 使用 Image J软件（NIH，Bethesda，MD，USA）测量伤口面积。伤口愈合百分比计算公式如下：伤口愈合百分比=（0 h的伤口面积-特定时间的伤口面积）/0 h的伤口面积×100%。

7.细胞免疫荧光实验

LoVo、HT29和HCT116细胞铺于含有无菌细胞载玻片的6孔板中。HIF-1α染色前，细胞进行乏氧（37℃，1%O2、5%CO2和 94%N2）预处理 24 h；GLUT-1染色前，细胞置于无血清培养基中饥饿预处理12 h。根据文献指导进行细胞免疫荧光染色［20］。 HIF-1α（Abcam，H1 alpha67，UK）和 GLUT-1（Abcam，ab40084，UK）一抗的工作浓度为 1∶100。采用共聚焦显微镜（Nikon，C2 si，Japan）拍摄图像。采用活细胞成像系统（NIS-Elements，Japan）定量细胞内蛋白质的表达水平。

8.免疫组化实验

将 LoVo、HT29和 HCT116皮下瘤标本置于10%甲醛液中固定 48 h，石蜡包埋，切片厚度3 μm。根据之前的文献指导进行免疫组化染色［21］。组织切片分别滴加HIF-1α和GLUT-1一抗置于4℃环境孵育过夜（工作浓度，1∶100）。 第二天，将组织切片与HRP标记的二抗（Boster，武汉）在室温下孵育1 h。最后，苏木精复染，于显微镜下观察（放大 200 倍，Olympus BX53，Japan）。 肿瘤细胞在细胞质或细胞膜中呈现棕黄色时，定义为HIF-1α和GLUT-1结果为阳性。

9.统计学分析

所有数据以均数±标准差表示。使用SPSS 19.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析结合最小显著差法比较三组数据之间的差异。采用Fisher精确检验比较肝转移潜能的差异。采用Pearson相关系数分析18F-FMISO定量参数与肝转移数量及肿瘤相关生物学指标之间的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.三种CRC细胞体外迁移能力评价（图1）

结果显示 LoVo 细胞[24 h，（25.27±0.6）%；48 h，（67.3±0.51）%]不同时间点的伤口闭合率大于HT29[24 h，（20.46±0.57）%；48 h，（29.32±0.43）%，P＜0.001]和 HCT116[24 h，（5.88±0.83）%；48 h，（18.42±0.73%），P＜0.001]细胞，揭示了 LoVo 细胞具有更强的体外迁移能力。

2.三种CLM模型体内转移潜能评价

20只LoVo模型中有12只（60%）发生了肝转移；20只HT29模型中有7只（35%）发生肝转移，20只HCT116模型中有3只（15%）发生肝转移（χ2=8.756，P=0.13）。 经统计，在 22 只发生肝转移的小鼠中有16只小鼠的肝转移瘤大于0.5 cm，大于0.5 cm的肝转移结节共35个（一个肝脏内可有多个直径大于 0.5 cm的结节）。此外，LoVo、HT29和HCT116 CLM小鼠的中位生存时间分别为 8.5、10 和 12 周（P＜0.001，图 2）。 与 LoVo和HT29 CLM小鼠比较，HCT116小鼠具有更长的生存时间。

3.18F-FMISO体外细胞摄取能力评价

三种细胞18F-FMISO体外核素摄取率随时间增加而增长（图3）。LoVo、HT29和HCT116细胞在30 min的18F-FMISO摄取率无统计学差异（P＞0.05）； 在 60和 120 min，LoVo细胞的18F-FMISO摄取率明显高于HT29和HCT116细胞（P＜0.001），但是，HT29和HCT116对18F-FMISO的摄取差异无统计学意义（P值分别为 0.265和 0.462，均＞0.05）；在 240 min 时，LoVo、HT29 和 HCT116 细胞两两间18F-FMISO摄取率差异均存在统计学意义（P＜0.01）。本结果表明不同转移潜能的CRC细胞系之间存在放射性核素摄取的多样性，这种现象也反映了CRC肿瘤细胞系之间的生物学行为差异。

图1 LoVo、HT29和HCT116细胞体外迁移实验。a)使用10 μl移液管尖端刮擦LoVo、HT29和HCT116细胞单层。在伤口形成后的0、24和48 h采集图像。图像放大倍数（×100）；b)LoVo、HT29和HCT116细胞的伤口愈合定量分析（%）。数据以均值±标准差表示，差异的显著性用星号（*）表示，***P＜0.001 图 2 LoVo、HT29和HCT116肝转移模型小鼠生存曲线 图 3 LoVo、HT29和HCT116体外细胞摄取实验。a)LoVo、HT29和HCT116体外18F-FMISO细胞摄取的时间曲线；b)18F-FMISO细胞摄取率定量直方图。数据以表示均值±标准偏差表示，差异的显著性用星号（*）表示，**P＜0.01；***P＜0.001

4.生物学指标检测（HIF-1α、GLUT-1）（图 4）

LoVo细胞GLUT-1和HIF-1α的平均荧光强度值显著高于 HT29细胞（29.3±5.63比 10.14±3.02 和 71.06±11.24 比 14.98±5.74，P＜0.0001），HT29细胞的GLUT-1和HIF-1α平均荧光强度值略高于HCT116细胞，但两者间的差异无统计学意义（10.14±3.02比 8.24±1.20和 14.98±5.74比10.04±3.26，P=0.155 和 P=0.268）。 免疫组化结果显示，LoVo皮下瘤的 GLUT-1和HIF-1α表达显著高于 HT29（51.21±3.36 比 35.89±3.45 和 21.15±3.40 比 10.46±2.16，P＜0.05）和 HCT116 （51.21±3.36比 23.46±1.82 和 21.15±3.40 比 5.83±1.26，P＜0.05）组织（图4d）。HT29皮下瘤组织中 GLUT-1的表达显著高于HCT116组织（P＜0.05）。三种细胞体内、体外GLUT-1和HIF-1α的表达高低与其转移潜能表现出一致性。

5.18F-FMISO T/L SUVmax定量参数可以鉴别CRC的转移潜能

笔者于18F-FMISO注射后4 h行Micro-PET显像。图5为LoVo、HT29和HCT116模型的18FFMISO PET图像及其对应的肝脏解剖图像。在肝转移模型中，18F-FMISO PET可以很好的显示直径大于等于0.5 cm的肝转移瘤。定量分析表明，皮下瘤的18F-FMISO T/L SUVmax值高于肝转移瘤（P＜0.05）；LoVo肝转移瘤和皮下移植瘤的T/L SUVmax值均显著高于 HT29和HCT116模型（P＜0.05，表1）。结果表明了，18F-FMISO T/L SUVmax定量参数可以鉴别不同转移潜能CRC细胞系的肝转移生物学行为。

6.相关性分析

在本实验中，肝转移瘤的体积明显小于皮下瘤。为此，在量化肿瘤乏氧程度时，皮下瘤的ROI勾勒会更准确。本研究发现肝转移瘤的18F-FMISO T/L SUVmax值与肝转移数量（大于0.5 cm的转移瘤）具有中度相关性（r=0.6408，P=0.0013）；在皮下瘤中，18F-FMISO T/L SUVmax定量参数与 HIF-1α（r=0.8145，P=0.0075）和 GLUT-1（r=0.8252，P=0.0062）的表达具有高度相关性。

表1 LoVo、HT29和HCT116动物模型18F-FMISO T/L SUVmax值比较

讨 论

在CRC患者中，约25%的患者在首次就诊时即发生肝转移（同时性），约50%的患者在原发病灶切除后3年内发生肝转移异时性［22,23］。肝转移是导致CRC死亡的主要原因。肿瘤异质性是影响肿瘤进展、转移、预后和疗效的关键因素，在CRC肝转移中扮演了重要的角色［24,25］。 Kim 等［26］研究证实，CRC进程中普遍存在基因亚型异质性，是肿瘤转移初始克隆行为的潜在驱动力。应用分子显像深入理解CRC转移相关生物学行为对早期检测肝转移和指导CRC患者个体化治疗至关重要。

在肿瘤进展过程中，乏氧微环境是一个动态的过程，并且与新生血管生成、肿瘤侵袭、肿瘤转移及肿瘤耐药密切相关［8,27］。PET显像可以量化肿瘤组织摄取示踪剂的程度，18F-FMISO注射后2 h的SUV值可反映实体肿瘤中的乏氧水平，进而预测其生物学特性［11,28］。本实验中，首先采用伤口愈合实验比较了三种CRC细胞的体外迁移能力，明确了体外迁移能力由高到低分别为：LoVo＞HT29＞HCT116。随后，进一步构建肝转移模型评价了其体内转移潜能。生存分析的结果显示，LoVo、HT29和HCT116肝转移小鼠的中位存活时间分别为8.5、10和 12周（P＜0.001）。 三种 CRC 细胞或模型在迁移、转移和生存时间的差异表明了CRC生物学行为的多样性。笔者选取皮下瘤进行ROI的勾勒及肿瘤FMISO摄取的量化，以减少因为肿瘤体积过小而引起的测量误差。结果显示，皮下瘤可更好的显示肿瘤乏氧区域，其T/L SUVmax值显著高于肝转移瘤，T/L SUVmax值由高到低分别为：LoVo＞HT29＞HCT116。18F-FMISO定量参数可以很好的区别三种不同转移潜能的CRC小鼠模型，结论与之前的研究结果一致，认为具有高转移潜能的LoVo细胞由于乏氧程度的增加表现出较强的放射性核素摄取能力［29,30］。

乏氧核心调控因子-1α（HIF-1α）和乏氧诱导生成的葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）都是与肿瘤进展及转移密切相关的生物学指标［31,32］。在Estrella等［33］研究中，发现具有高葡萄糖代谢的恶性肿瘤细胞其微环境呈酸性，促进了肿瘤的侵袭和转移，另外也显示肿瘤组织高GLUT-1表达的区域也是具有高侵袭行为的区域。结果显示，与HT29和HCT116相比，LoVo细胞在体内和体外均表现出更强的GLUT-1和HIF-1α染色，且18F-FMISO定量参数与肝转移数量及GLUT-1和HIF-1α的表达具有相关性，说明18F-FMISO的定量参数也反映了肿瘤间蛋白水平表达的异质性［31］。正如之前的研究所述，乏氧为肿瘤的发生、发展创造了适宜的微环境，具有高侵袭能力的肿瘤可促进18FFMISO的摄取［30,32］。相似的一项PET荟萃分析结果表明，乏氧示踪剂高浓聚的恶性肿瘤趋向于不良预后结局［34］。

本研究也具有一定的局限性，三种细胞系不能代表所有的CRC，会在未来的实验中增加细胞系的种类，以便更全面、综合的分析CRC的生物学特性，并选择更多定量参数阐明18F-FMISO PET在预测CRC肝转移潜能中的应用价值。

18F-FMISO定量参数T/L SUVmax值为小鼠CRC肝转移提供了有价值的分子影像信息，其在预测CRC肝转移潜能方面具有一定的应用价值。