翅果油对高脂饮食小鼠的降脂减肥作用

郭彩霞1,韩 丽1,乔进平1,张生万1,李美萍1,李 娟

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西琪尔康生物制品有限公司,山西临汾 041000)

随着经济的发展,人们的生活方式开始发生改变,高脂高热量饮食以及多坐少动的生活方式成为主流,导致肥胖发生率逐年上升。据世界卫生组织2017年10月的报道,相比1975年,世界肥胖人数增长了约三倍[1]。与此同时,肥胖的发生增加了患高血脂、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等慢性疾病的风险,已成为影响人们健康和生活质量的重要因素之一。目前,减肥的方法主要有热量限制结合运动、药物治疗法等。其中热量限制结合运动的方法由于热量摄入受限致使机体长期处于能量负平衡状态,从而导致机体产生能量-节约机制,长期减肥效果不明显[2]。而药物治疗虽然能有效控制体重增加,但是长期服用药物可能会产生毒副作用。因此,食源性的功能食品在预防和治疗肥胖中的作用已经引起了人们的广泛关注[3-4]。

翅果油(Elaeagnusmollisoil,EMO)是从翅果油树种仁中提取的一种油脂,富含不饱和脂肪酸、维生素E、植物甾醇等,具有很好的降血脂、抗氧化及预防肥胖作用[5]。黄玲等对翅果油进行抗氧化能力的研究,结果表明其抗氧化作用优于单纯维生素E,略强于沙棘油[6];陈雨娜发现翅果油有助于提高小鼠机体抗氧化能力和血脂调节能力[7];白谊涵等探讨翅果油胶囊对高脂血症患者血脂的影响及不良反应,结果显示翅果油胶囊对高脂血症患者血脂具有明显的调节作用,且安全性和耐受性良好[8]。目前对于翅果油的功能性质研究主要集中在改善血脂及抗氧化能力上,而对于翅果油预防肥胖作用方面的研究鲜有报道。本研究以C57BL/6小鼠作为受试动物,对翅果油干预对高脂饮食小鼠降脂减肥的作用进行研究,以期为翅果油预防肥胖及相关疾病的作用提供理论依据,为翅果油的开发与利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级4周龄的雄性C57BL/6小鼠(17～20 g) 南京君科生物工程有限公司,生产许可证编号:SCXK(苏)2016-0010;翅果油 山西琪尔康翅果生物制品有限公司;基础饲料 山西医科大学实验动物中心;45%高脂饲料(D12451) 北京科澳协力饲料有限公司,生产许可证编号:SCXK(京)2014-0010;甘油三酯、总胆固醇、低密度胆固醇检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;总RNA提取试剂盒 天跟生化科技有限公司;UEIris RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis试剂盒、SYBR2×/Fast Super EvaGreen qPCR Master 苏州宇恒生物科技有限公司;甲醛、苏木精、伊红、无水乙醇、二甲苯、硫酸铝钾、甘油、碘酸钠等 均为分析纯,山西吉泰禾试剂公司。

JA5003型分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;FYL-YS-50L型恒温培养箱 北京福意电器有限公司;KDC-140HR型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;SynergyMx多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;莱卡RM2255石蜡切片机 德国莱卡公司;ZKPJ-1A展烤片机 天津天利航空机电有限公司;CX31光学显微镜 日本奥林巴斯有限公司;T100 PCR仪、电泳仪 美国伯乐BIO-RAD公司;ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪 美国Applied Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组与饲养 40只C57BL/6小鼠适应性喂养2周,动物饲养条件为:温度20～26 ℃,湿度40%～60%,12 h光照12 h黑暗,小鼠自由摄食饮水。每天观察小鼠基本状态,记录每天小鼠摄食量,每周称量体重,每3 d换一次垫料。适应性喂养2周后,随机分为5组(n=8):正常组(Normal Diet group,ND)、高脂饮食组(High-fat Diet group,HFD)、翅果油低剂量组(Low-doseElaeagnusmollisoil group,LE)、翅果油中剂量组(Middle-doseElaeagnusmollisoil group,ME)和翅果油高剂量组(High-doseElaeagnusmollisoil group,HE)。ND组给予基础饲料,HFD组给予45%高脂饲料,LE、ME、HE组给予45%高脂饲料并分别灌胃1.5、3.0、6.0 g/kg·d翅果油。灌胃剂量选取:根据2017中国居民膳食指南,人体每日推荐油脂摄入量为25 g,成人重按60 kg计算,即成人每日油脂摄入量为0.42 g/kg。灌胃剂量根据动物与人体等效剂量换算[9],且小鼠灌胃1.5、3.0、6.0 g/kg·d分别相当于人体每日推荐量的0.5、1、2倍。正常组和高脂饮食组每天灌胃0.2 mL生理盐水,灌胃时间为每天早上8:00,连续干预8周。实验期间各组小鼠自由采食和饮水,每天记录小鼠的摄食量,计算在整个饲养过程中每日每只老鼠摄食量的平均值,并按照基础饲料3.85 kcal/g、高脂饲料4.73 kcal/g和翅果油9.0 kcal/g乘以各自摄入量来计算摄入热量。

1.2.2 样品收集与处理 干预8周后,小鼠禁食不禁水12 h,皮下注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉(60 mg/kg)。摘眼球取血,采血完成后,迅速剥离脂肪组织用冰冷的生理盐水清洗掉表面血水后用吸水纸擦干,称重。选取脂肪组织中较规则部分,并切成立方体(1 cm×1 cm×0.5 cm)置于包埋盒中投入10%中性甲醛溶液中固定3周以上,避光保存,用于组织病理的观察,其余组织置于液氮中速冻,并于-80 ℃保存备用。

1.2.3 小鼠体重、体长和Lee’s指数测定 小鼠体重每周测一次;干预实验结束后,测小鼠体长(鼻尖到肛门的长度),按式(1)计算Lee’s指数。

式(1)

式中:L为小鼠体长(cm),m为小鼠体重(g)。

1.2.4 小鼠肝脏、血清生化指标测定 将小鼠处死后,取肝脏根据试剂盒说明书测定TG、TC。

血液离心后,取上清液根据试剂盒说明书测定TG、TC、HDL-C,并按式(2)计算低密度脂蛋白胆固醇含量[10],按式(3)计算动脉粥样硬化指数AI。

式(2)

式(3)

式中:CLDL-C为低密度脂蛋白胆固醇含量(mmol/L),CTC为总胆固醇含量(mmol/L),CTG为甘油三酯含量(mmol/L),CHDL-C为高密度脂蛋白胆固醇含量(mmol/L)。

1.2.5 小鼠肝脏系数和脂肪系数的测定 将小鼠处死后,取肝脏和皮下、附睾和肾周围白色脂肪组织,电子天平称量其湿重,并计算肝脏系数和脂肪系数。

式(4)

式(5)

式中:m为小鼠体重(g),m1为小鼠肝脏重(g),m2为小鼠皮下、附睾和肾周围白色脂肪组织总重(g)。

1.2.6 脂肪组织病理学观察 取同一部位的脂肪组织经10%甲醛溶液固定,将固定好的组织进行流水冲洗、梯度酒精脱水、石蜡包埋、6 μm厚度的常规切片,采用HE染色法染色。随后在光学显微镜下对每个样本40×物镜下随机选取5个视野进行观察和图像分析,运用AxioVision Real 4.6 软件分析测量脂肪细胞面积,取平均值。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 小鼠状态观察

饲养过程中,观察和记录各组小鼠状态发现各组小鼠精神状态良好,毛色正常,毛发光滑柔顺,摄食饮水排便无异常,生长发育良好,说明喂食45%的高脂饲料及灌胃翅果油不会对小鼠状态及生长状况产生不利影响。

2.2 翅果油干预对高脂饮食小鼠摄食量及摄入热量的影响

由图1可知,各组小鼠摄食量具有显著性差异(P<0.05)。与ND组相比,HFD组小鼠摄食量显著降低(P<0.05),这可能是因为长期食用高油脂、高热量的饮食,容易使小鼠产生饱腹感,抑制小鼠食欲,从而降低了摄食量[12]。与HFD组相比,翅果油干预后摄食量显著降低(P<0.05),说明翅果油对小鼠的摄食量具有一定的干预作用。与ND组相比,HFD组小鼠摄入热量较高,翅果油各剂量干预后有所下降,但各组小鼠的摄入热量不具有显著性差异(P>0.05)。

图1 翅果油对高脂饮食小鼠摄食量和摄入热量的影响 Fig.1 Effect of EMO on food and caloric intake of high-diet mice注:与ND组比较,*表示有显著性差异(P<0.05)， **表示极显著性差异(P<0.01);与HFD组比较,#表示有显著性差异(P<0.05), ##表示有极显著性差异(P<0.01);图2a、图2c同。

2.3 翅果油干预对高脂饮食小鼠体重的影响

体重增加是形成肥胖的最直观体现,因此体重是判断肥胖的一个重要指标[11],各组小鼠体重变化如表1所示,由结果可以看出,小鼠喂养前3周,与ND组相比,HFD组小鼠体重增长无显著性差异(P>0.05);喂养4周后,高脂饮食组小鼠体重显著高于正常组小鼠(P<0.05);喂养5周后,与ND组相比,HFD组小鼠体重具有极显著差异(P<0.01),喂养8周后,HFD组小鼠体重超过正常组小鼠体重的27.56%,表明高脂饮食可以诱导肥胖形成。

由表1可知,与HFD组相比,干预5周时,ME组和HE组小鼠体重显著低于HFD组(P<0.05);干预6周时,LE组小鼠体重显著低于HFD组(P<0.05),ME和HE组小鼠体重极显著低于HFD组(P<0.01),且随着干预时间的延长,翅果油对高脂饮食小鼠体重的降低作用越来越明显;干预8周时LE、ME和HE组小鼠体重与HFD组小鼠比较,分别极显著降低了8.33%、14.78%和10.09%(P<0.01),说明翅果油对高脂饮食引起的肥胖具有明显的抑制作用,且ME组干预效果最好,HE和LE组次之。

2.4 翅果油干预对高脂饮食小鼠Lee’s指数的影响

Lee’s指数综合反映了体重与体长的比例关系,是评价肥胖程度的有效指数[13-14]。由表2可知,与ND组相比,HFD组小鼠Lee’s指数极显著升高了6.16%(P<0.01);与HFD组相比,LE、ME和HE组小鼠Lee’s指数分别降低了1.10%、3.68%和2.39%,其中ME组Lee’s指数与ND组无显著性差异(P>0.05)。

表1 翅果油对高脂饮食小鼠体重的影响Table 1 Effect of EMO on weight of high-diet

注:与ND组比较,*表示有显著性差异(P<0.05),**表示有极显著差异(P<0.01);与HFD组比较,#表示有显著性差异(P<0.05),##表示有极显著差异(P<0.01);表2～表4同。

表2 翅果油对高脂饮食小鼠Lee’s指数的影响Table 2 Effect of EMO on Lee’s index of

2.5 翅果油干预对高脂饮食小鼠肝脏、肝脏系数及肝脂的影响

内脏脂肪重量的增加是诊断肥胖发生的一个重要依据[15],且肝脏是参与体内脂质合成和代谢的主要靶器官[16],因此肝脏脂质沉积也是形成肥胖的主要原因之一。由表3可知,与ND组相比,HFD组小鼠肝重极显著升高(P<0.01);与HFD组相比,LE、ME和HE组肝重,分别显著降低了9.63%、13.33%和12.59%(P<0.05)。此外,与ND组相比,HFD组小鼠肝脏TC和TG含量均极显著升高(P<0.01);与HFD组相比,翅果油各剂量组肝脏TC含量有所降低,但效果不显著(P>0.05),LE、ME组肝脏TG含量极显著降低(P<0.01),HE组降低肝脏TG含量不显著(P>0.05);综上可知,翅果油干预可以缓解高脂饮食造成的肝脏脂质沉积,且中剂量组作用效果较好。

表3 翅果油对高脂饮食小鼠肝重、肝脏系数、肝脏TC和TG的影响Table 3 Effect of EMO on liver,liver index,hepatic TC and TG of high-diet

表4 翅果油对高脂饮食小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C及AI的影响Table 4 Effect of EMO on serum TC,TG,HDL-C,LDL-C,and AI of high-diet

2.6 翅果油干预对高脂饮食小鼠血脂含量及AI的影响

肥胖会导致脂代谢发生紊乱,主要表现为血液中TC、TG及LDL-C含量升高,HDL-C含量降低,并且血脂含量异常增加了动脉粥样硬化、心血管疾病及高血压等代谢疾病发生的概率[17-18]。由表4可知,与ND组相比,高脂饮食组血清中TC、TG及LDL-C含量均极显著升高(P<0.01),说明高脂饮食诱导小鼠血脂代谢紊乱;与高脂饮食组相比,翅果油低、中、高剂量组血清中TC、TG及LDL-C含量均显著降低(P<0.05)。其中TC含量分别降低了47.03%、47.82%和35.57%;TG含量分别降低了28.28%、30.34%和22.07%;LDL-C含量分别降低了63.91%、69.23%和53.58%。与HFD组相比,翅果油低、中、高剂量组HDL-C含量有所上升,AI值有所下降,但改善效果不显著(P>0.05)。以上结果表明翅果油可有效改善高脂饮食诱导的高脂血症。

2.7 翅果油干预对高脂饮食小鼠脂肪重、脂肪系数、脂肪组织病理切片及脂肪细胞面积的影响

如图2a所示,与ND组相比,HFD组脂肪重及脂肪系数极显著升高(P<0.01),且脂肪重超过低脂对照组222.61%;与HFD组相比,翅果油低、中、高剂量组小鼠白色脂肪重及脂肪系数均显著降低(P<0.05),脂肪重分别降低了11.05%、22.37% 和10.24%,说明翅果油具有一定降低体内脂肪含量的作用,且中剂量组降脂效果最佳。

图2 翅果油对高脂饮食小鼠脂肪重及脂肪系数、脂肪细胞大小和脂肪细胞面积的影响Fig.2 Effect of EMO on fat,fat coefficient,adipocyte size and adipocyte area size of high-diet mice注:a:脂肪重及脂肪系数;b:HE染色(400×);c:脂肪细胞面积。

如图2b所示,正常组脂肪细胞排列整齐、分布均匀且大小一致;与ND组相比,HFD组脂肪细胞变大、大小不均,显微镜相同视野下脂肪细胞数量明显减少;与HFD组相比,翅果油剂量组脂肪细胞直径有所减小,细胞排列整齐,显微镜相同视野下脂肪细胞有所增多。如图2c所示,与ND相比,HFD组脂肪细胞面积极显著增大(P<0.01),与高脂饮食组相比,翅果油剂量组脂肪细胞面积均有所减小,其中中剂量组效果较好。有学者研究发现,在啮齿动物和人类中,脂肪作为能量储存在白色脂肪组织(White adipose tissue,WAT)中,健康WAT的主要特征是存在更小和更多的脂肪细胞[19]。当机体肥胖时,脂肪量增加,主要表现为脂肪细胞肥大(细胞大小增加)或脂肪细胞增生(通过从最初的脂肪细胞分化从而增加脂肪细胞数量)[20]。已有研究发现抑制由于脂肪细胞数量增加(增生)和细胞增大(肥大)引起的脂肪组织扩张,可以作为预防和或治疗肥胖症的重要方法[21-22]。本实验中,通过观察脂肪组织病理学切片可以看出:高脂饮食导致脂肪组织细胞增大,翅果油干预后脂肪细胞有所减小;通过脂肪细胞面积图更直观地反映出翅果油干预可以减小脂肪细胞面积。说明翅果油可以通过抑制脂肪细胞增大而达到预防肥胖的目的。

表5 小鼠脂肪重、脂肪细胞面积、肝脏TC、TG和血脂水平之间的相关性分析Table 5 Correlation analysis of fat mass,adipocyte area size,liver TC,TG and blood lipid levels

注：*.在0.05水平上显著相关;**.在0.01水平上显著相关。

2.8 相关性分析

如表5所示,脂肪重与脂肪细胞面积呈显著正相关(P<0.05),说明高脂饮食能引起脂肪组织的堆积,这可能与脂肪细胞面积增大有关;脂肪重、脂肪细胞面积与肝脏TC和TG呈显著正相关(P<0.05),即脂肪重量增加时,肝脏血脂水平升高。有文献报道,当体内脂肪量过度增加时,会刺激脂肪组织中TG快速分解形成游离脂肪酸,游离脂肪酸经血液循环到达肝脏,在肝脏中重新合成TG。这一过程使肝脏中TG合成速率大于TG分解速率,从而导致肝脏脂质积累量增多[23],实验得到结果,脂肪重与肝脏脂质呈显著正相关(P<0.05)，与报道中结果相一致。肥胖最先诱发的是高血脂症和非酒精性脂肪肝,而非酒精性脂肪肝的一个重要特征就是肝脏脂质沉积[24],更为严重的是,当机体内脂肪组织过度积累达到其储存容量时,就会发生脂肪细胞死亡、炎症和纤维化[25]。因此,内脏脂肪细胞是否健康,是肥胖机体代谢是否正常的关键决定因素[26]。

此外,由表5还可以看出,脂肪重与血清HDL-C呈极显著负相关(P<0.01),与AI值呈极显著正相关(P<0.01),说明减少机体脂肪的含量还可以有效地预防高血脂症及动脉粥样硬化的发生。其原因可能是,高脂血症是驱动动脉粥样硬化发展的重要危险因素,且增加了中风和其他心血管疾病的风险[27],降低血清中TC、TG、LDL-C含量,升高HDL-C含量便可达到治疗高脂血症的目的,且HDL-C是拮抗动脉粥样硬化的脂蛋白[28],HDL-C水平提高可有效预防动脉粥样硬化。因此,翅果油干预可以通过抑制由高脂饮食诱发的肥胖降低机体高血脂症及相关代谢疾病发生的概率。

3 结论

本研究以C57BL/6小鼠为实验对象,通过对高脂饮食小鼠进行翅果油干预,证实低剂量和中剂量翅果油能够显著降低小鼠体质量、血清TG、TC、LDL-C含量、肝脏TG含量(P<0.05)以及抑制脂肪细胞增大,且翅果油中剂量干预效果较好,说明摄入翅果油对于预防高血脂、肥胖及相关疾病具有一定的功效,但其降脂减肥机理还需进一步深入研究,从而为翅果油产品的开发和应用提供理论依据。